Плюрипотентные стволовые клетки: Способы получения плюрипотентных клеток

Содержание

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки как модель для изучения болезней человека

Известно, что индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) способны к бесконечному самовозобновлению и дифференцировке во все типы клеток. Обзор посвящен современным методам и подходам к созданию моделей заболеваний на основе ИПСК человека; недавним достижениям и перспективам в этой области, а также применению таких моделей для изучения заболеваний человека.

Введение

Первые линии плюрипотентных стволовых клеток были получены из внутренней клеточной массы бластоцисты мыши в 1981 г. двумя группами исследователей [1, 2]. Их назвали эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК). Было показано, что ЭСК в специально подобранных условиях культивирования способны длительное время пролиферировать in vitro, оставаясь при этом плюрипотентными. При трансплантации иммунодефицитным мышам ЭСК формируют тератома-подобные новообразования, в составе которых можно идентифицировать производные эктодермы, мезодермы и энтодермы. In vitro ЭСК также способны дифференцироваться в клетки – производные трех зародышевых листков.

Важным свойством ЭСК является то, что, несмотря на длительное существование в культуре in vitro, они сохраняют свойство клеток внутренней клеточной массы, из которой они произошли, а именно, способность полностью выполнить программу онтогенетического развития при обратной имплантации в бластоцисту. В химерных мышах, полученных таким образом, производные ЭСК могут присутствовать во всех тканях, включая клетки зародышевого пути. С ЭСК мыши можно проводить генетические манипуляции in vitro, а затем получать гетерозиготных или гомозиготных мутантных мышей

[3, 4]. Эти уникальные свойства ЭСК позволили найти широкое практическое применение для них. Так, за открытие принципов введения специфических генных модификаций в организм мышей посредством эмбриональных стволовых клеток, то есть за изобретение метода нокаута генов, в 2007 г. М. Эвансу, О. Смитису и М. Капеччи была присуждена Нобелевская премия по медицине.

С момента выделения первых линий ЭСК человека в 1998 г. Джеймсом Томсоном и соавт.

[5], исследователей интересовал вопрос о получении плюрипотентных стволовых клеток с генотипом конкретного человека, поскольку такие клетки могли бы найти широкое применение в регенеративной медицине и моделировании человеческих заболеваний, что сделало бы их важным тест-объектом. Однако только в 2007 г. удалось получить плюрипотентные стволовые клетки с генотипом конкретного пациента методом индукции плюрипотентного состояния в соматической клетке [6, 7].

Индукция плюрипотентности

Задолго до того, как были получены первые линии эмбриональных стволовых клеток, Д.Б. Гордон и соавт. (1959, 1960) показали, что замена ядра овоцита коричневой лягушки вида Xenopus laevis на ядро соматической клетки лягушки-альбиноса того же вида приводит к образованию клетки, способной развиться в лягушку-альбиноса

[8, 9]. Таким образом, впервые была показана возможность репрограммирования ядра соматической клетки до плюрипотентного состояния. В 1997 г. Ян Вильмут и соавт. сообщили о клонировании первого млекопитающего (овечки Долли) методом переноса ядра соматической клетки в энуклеированный овоцит [10]. Это исследование в совокупности с получением линий ЭСК человека в 1998 г. обозначило возможность получения эмбриональных стволовых клеток с генотипом конкретного пациента. Стоит отметить, что механизмы и молекулы, ответственные за феномен репрограммирования ядра соматической клетки, остаются до настоящего времени все еще в значительной степени непонятыми.

Независимые группы исследователей показали, что индуцировать плюрипотентное состояние возможно слиянием соматической клетки и ЭСК [11– 13]. Однако эти подходы не получили широкого распространения.

В 2006 г. профессору Ш. Яманака удалось идентифицировать набор транскрипционных факторов, введение которых в соматические клетки переводит их в ЭСК-подобное состояние [14]. Такие клетки были названы индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (ИПСК).

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки

ИПСК получают из соматических клеток, репрограммируя их до плюрипотентного состояния с помощью набора определенных транскрипционных факторов. В 2006 г. научной группой профессора Ш. Яманака был проведен анализ влияния 24 факторов, тем или иным образом вовлеченных в процессы становления и (или) поддержания плюрипотентности. Используя ретровирусную трансфекцию, авторы произвели трансформацию мышиных эмбриональных фибробластов различными комбинациями данных факторов. В результате экспериментальной работы было установлено, что использование комбинации факторов Oct-4, Sox2, c-Myc и Klf4 необходимо и достаточно для индукции плюрипотентного состояния в мышиных эмбриональных фибробластах

[14]. Та же самая комбинация факторов способна индуцировать плюрипотентное состояние в клетках человека [6]. Группа Джеймса Томпсона позже идентифицировала частично перекрывающуюся комбинацию факторов – Oct4, Sox2, Nanog и Lin-28 [7]. Хотя получение линий ИПСК выглядит концептуально и технически простой процедурой, репрограммирование – это процесс, включающий в себя много неизученных событий. На сегодняшний день этот процесс широко исследуется во многих лабораториях мира [15].

ИПСК являются на сегодняшний день более перспективными для применения в регенеративной медицине, чем ЭСК. Их получение не требует использования человеческих бластоцист, которые остаются невостребованными после процедуры экстракорпорального оплодотворения, что снимает этические проблемы. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, как и эмбриональные стволовые клетки, имеют нормальный кариотип, экспрессируют маркерные гены плюрипотентности. Другим преимуществом ИПСК является то, что они в перспективе могут быть получены рутинными методами из клеток любого пациента, что снимает проблемы иммунологической совместимости (рис. 1).

ИПСК и ЭСК

Выяснение эквивалентности ИПСК и ЭСК – это сложный и не разрешенный на сегодняшний день вопрос [16]. Генетические и эпигенетические отличия ЭСК и ИПСК способны влиять на процесс дифференцировки ИПСК, что может привести при дифференцировке к появлению клеток с профилями экспрессии генов и биологическими характеристиками, отличными от клеток, полученных из ЭСК [16].

Критерии, используемые для сравнения ИПСК и ЭСК – это биологические тесты на способность к дифференцировке и молекулярные анализы профилей экспрессии генов, эпигенетических характеристик. Тесты на способность к дифференцировке считают ключевыми в доказательстве плюрипотентности клеток. Для индуцированных плюрипотентных стволовых клеток мыши в качестве основного теста на способность к дифференцировке обычно исполь зуется тест на формирование жизнеспособных химер

[16]. В 2009 г. методом инъекции диплоидных ИПСК в тетраплоидную бластоцисту (тетраплоидная комплементация) была получена мышь, организм которой полностью развился из ИПСК, что указывает на эквивалентность некоторых линий ИПСК по своей способности к дифференцировке эмбриональным стволовым клеткам [17].

В случае клеток человека исследователям доступны только менее строгие тесты, такие как in vitro дифференцировки, формирование тератомаподобных новообразований при введении иммунодефицитным мышам и способность к образованию эмбриоидных телец. Способность к формированию тератома-подобных новообразований является необходимым и достаточным тестом для того, чтобы определять клетки человека как плюрипотентные

[16].

Модели заболеваний на основе ИПСК

Несмотря на то, что модели на животных продолжают оставаться важным методом изучения заболеваний, такие подходы имеют множество ограничений, которые могут быть преодолены с помощью моделей болезней на основе ИПСК. Таким ограничением, в частности, является отсутствие адекватных моделей на животных для некоторых заболеваний человека.

Благодаря возможности получения ИПСК от любого пациента в совокупности с возможностью их дифференцировки практически в любой клеточный тип модели заболеваний на основе ИПСК потенциально могут быть созданы для любой, даже самой редкой болезни (рис. 2). Способность ИПСК бесконечно пролиферировать и дифференцироваться in vitro в детерминированных условиях позволяет такие модели стандартизировать и автоматизировать. Так как технологии получения, культивирования и дифференцировки ИПСК активно развиваются, можно ожидать, что модели заболеваний на основе ИПСК будут значительно дешевле животных моделей.

Современные стратегии создания клеточных моделей болезней на основе ИПСК

Для заболеваний, имеющих выраженную генетическую этиологию, создание модели болезни человека с помощью технологии ИПСК производится в два этапа: сначала получают ИПСК из соматических клеток пациента, а затем дифференцируют их в клеточные типы, связанные с моделируемой болезнью [18].

Первый вопрос, который возникает перед исследователем – это выбор исходного типа соматических клеток для получения ИПСК. ИПСК уже удалось получить из фибробластов [19], кератиноцитов [20], эндотелиальных клеток

[21], нейральных стволовых клеток [22], CD34+ клеток [23] и некоторых других. В большинстве случаев мутация, вызывающая патологию, является наследственной, и, следовательно, содержится во всех клетках пациента. В таких случаях разумно использовать фибробласты кожи, так как их легко культивировать и получать от пациентов с помощью несложной и малоинвазивной процедуры биопсии кожи [18]. А.Д. Эберт и соавт. получили ИПСК из фибробластов кожи ребенка, больного спинальной мышечной атрофией первого типа (МКБ-10 G12.0), затем дифференцировали их в моторные нейроны и культивировали в течение двух недель. Полученные нейроны имели меньший размер и худшую выживаемость по сравнению с нейронами, полученными из ИПСК дикого типа [19]. В случае соматических мутаций только некоторая часть клеток организма содержит мутантный ген, что может вызвать необходимость использовать другие типы клеток. Например, истинная полицитемия является следствием соматической мутации, которая присутствует в CD34+ клетках пациента. Специалисты из университета Джона Хопкинса получили ИПСК из CD34+ клеток двух пациентов, страдающих истинной полицитемией (МКБ-10 D45), причиной которой является соматическая мутация JAK2-V617F. Мутантные линии ИПСК затем дифференцировали в CD34+ клетки и показали повышенную пролиферацию полученных клеток, характерную для данной патологии
[23]
.

Следующий вопрос – это выбор технологии репрограммирования соматических клеток до плюрипотентного состояния. На сегодняшний день наиболее совершенными и перспективными для применения как в регенеративной медицине, так и в моделировании болезней являются ИПСК без геномных интеграций, так как остаточная экспрессия интегрированных копий генов факторов репрограммирования может влиять на профили генной экспрессии и потенциально изменить биологические свойства полученных из ИПСК дифференцированных клеток.Некоторое время назад технологии получения ИПСК без геномных интеграций имели низкую эффективность и поэтому не были широко распространены, однако недавно были описаны высокоэффективные методы получения ИПСК без геномных интеграций

[24, 25]. В процессе репрограммирования образуется множество ЭСК-подобных колоний, многие из которых являются трансформированными клетками и не полностью репрограмироваными клонами, поэтому каждая новая линия ИПСК перед дальнейшим использованием в работе должна быть охарактеризована и тщательно протестирована на наличие плюрипотентности [18].

В большинстве случаев вызываемые мутацией нарушения наблюдаются только в дифференцированных клетках и никак не проявляются в ИПСК. Таким образом, на следующем шаге конструирования модели болезни необходимо дифференцировать ИПСК в подверженные патологическим изменениям типы клеток. Уже существуют протоколы дифференцировки ИПСК в нейрональные предшественники

[26], моторные нейроны [27], дофамин-продуцирующие нейроны [28], пигментный эпителий сетчатки [29], гепатоциты [30], CD34+ клетки [23], адипоциты [31], эндотелиальные клетки [32] и фибробласты [33]. В процессе дифференцировки, который может занять многие недели, образуются клетки различных типов. Эти клетки перед использованием должны быть охарактеризованы. Как правило, клетки анализируют по поверхностным антигенам и экспрессии ключевых транскрипционных факторов [18], а также проводят функциональные тесты, специфические для каждого типа клеток. Например, нейроны должны образовывать функциональные синапсы, эндотелиальные клетки – образовывать сосудоподобные структуры. Безусловно, очень важно показать функциональность клеток in vivo, при введении иммунодефицитным животным.

Немаловажным фактором построения успешной модели заболевания является выбор контрольных клеток для выявления патологических изменений. Для контрольного сравнения с ИПСК от пациента может быть использован широкий спектр контрольных клеточных линий, таких как охарактеризованные линии эмбриональных стволовых клеток и охарактеризованные линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток от здоровых доноров [18].

В общем случае, для создания модели болезни необходимо использовать наборы линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных от нескольких пациентов, чтобы убедиться, что наблюдаемые эффекты не являются специфическими для данной клеточной линии или определенного пациента. Учитывая генетические различия, которые существуют между неродственными людьми, контрольные клетки, полученные от здоровых родственников пациента, вероятно, будут давать меньшую ошибку в процессе сравнения. Для моногенных заболеваний ИПСК с исправленной генетической мутацией могут служить идеальным изогенным контролем. В случае болезней, вызванных соматическими мутациями, линии ИПСК, полученные из незатронутых мутацией клеток, могут быть использованы в качестве контроля. Например, при хронических миелопролиферативных заболеваниях, которые характеризуются генетическими нарушениями в гемопоэтической системе, линии ИПСК, полученные из кожи пациента, могут служить в качестве контрольных линий для исследования линий ИПСК, полученных из крови пациента [23].

Применение клеточных моделей на основе ИПСК для изучения нейродегенеративных заболеваний

Нейродегенеративные заболевания представляют большую группу различных нарушений, которые сводятся к тому, что определенные группы нейронов деградируют и гибнут. В большинстве случаев, эти нарушения возникают по неизвестным причинам и постоянно прогрессируют. Согласно докладу Всемирной организации здравоохранения (2005), нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, другие деменции и болезнь Паркинсона составили более 14% от общего числа неврологических заболеваний, и их уровень, как ожидают, повысится вместе с продолжительностью жизни в промышленно развитых странах [34]. Подавляющее большинство современных лекарственных препаратов предоставляют только ограниченную помощь пациентам, облегчая определенные симптомы. Более того, их постоянное использование часто вызывает серьезные побочные эффекты, и, видимо, ни один курс лечения не препятствует естественному развитию хронических болезней. Разработке эффективных профилактических и протективных методов лечения нейродегенеративных заболеваний препятствует наше ограниченное знание нейробиологии этих тяжелых состояний и нехватка адекватных модельных систем [35].

Модели нейродегенеративных заболеваний на основе ИПСК, помимо их применения для поиска новых лекарств, вероятно, позволят преодолеть трудности в изучении механизмов развития нейродегенеративных заболеваний, которые отчасти связаны с ограниченным доступом к человеческим нервным клеткам. Благодаря применению ИПСК уже удалось продвинуться в изучении механизмов некоторых болезней нервной системы.

Семейная дизавтономия является редкой периферической нейропатией, вызванной точечной мутацией в гене IKBKAP. Г. Ли и соавт. (2009) получили ИПСК от трех пациентов, больных семейной дизавтономией. Затем они дифференцировали их в клетки-производные всех трех зародышевых листков, в том числе в периферические нейроны. Анализ экспрессии генов в производных ИПСК показал тканеспецифичный аберрантный сплайсинг транскрипта IKBKAP in vitro. В клетках нервного гребня наблюдался особенно низкий уровень экспрессии нормального транскрипта IKBKAP. In vitro тесты показали заметные отличия в нейрональной дифференцировке содержащих мутацию ИПСК и миграционном поведении полученных клеток нервного гребня. Исследователи также использовали ИПСК для изучения воздействия лекарств-кандидатов на аберрантный сплайсинг и функциональные клеточные тесты [36].

К.Д. Бреннанд и соавт. (2011) получили ИПСК от четырех пациентов, больных шизофренией, а затем дифференцировали их в нейроны. Они обнаружили, что нейроны из ИПСК пациентов больных шизофренией образуют меньшее количество нейронных связей, чем нейроны, полученные из нормальных ИПСК. Затем был проведен сравнительный анализ экспрессии генов в полученных группах нейронов, в результате было обнаружено 596 дифференциаль но экспрессированных генов, 25% из которых ранее связывали с шизофренией. Результаты исследования не только подтвердили основные гипотезы о молекулярных механизмах шизофрении, но и идентифицировали сигнальные пути, которые ранее не связывали с этой болезнью [37].

Перспективы развития технологий моделирования болезней, основанных на ИПСК

Подход к моделированию и изучению патогенеза заболеваний с помощью ИПСК был успешно применен для целого ряда заболеваний [19, 23, 38–42]. Вместе с тем, стратегии моделирования более сложных болезней сопряжены со значительными трудностями [18].

Во-первых, сложно моделировать многие болезни старческой возрастной группы, такие как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона, несмотря на то, что динамика прогрессии болезней в клеточных типах, полученных путем in vitro дифференцировки ИПСК, будет, вероятно, весьма отличаться от прогрессии болезни у пациента [43]. Одна из возможностей преодоления этой проблемы – искусственное ускорение появления патологических фенотипов в культуре клеток, чего можно добиться, подвергая клетки воздействию внешних факторов, таких, как например оксидативный стресс, который может поспособствовать проявлению болезни.

Другая серьезная проблема изучения патогенеза болезни заключается в том, что могут возникнуть трудности с моделированием болезни in vitro на одном типе клеток. Для решения этой задачи необходимо реконструировать возможные взаимодействия различных типов клеток в ткани. В некоторых случаях требуются типы клеток, для получения которых из ИПСК еще не существует протоколов дифференцировки [18]. Например, еще не удалось получить из ИПСК фолликулярные эндокриноциты.

И, наконец, болезни со значительной эпигенетической составляющей может быть трудно изучать с помощью моделей на основе ИПСК, так как процесс репрограммирования скорее всего удалит любые эпигенетические изменения, связанные с возникновением патологического фенотипа. Эта проблема особенно актуальна для спорадических и многофакторных нарушений, вызванных комбинацией генетических особенностей и воздействия факторов окружающей среды [18]. Внешние факторы, такие как токсичные металлы и пестициды, образ жизни и особенности диеты коррелируют с повышенным риском развития некоторых болезней и могут вызвать изменения в эпигеноме [44]. Таким образом, ИПСК от пациентов со спорадическими заболеваниями, которые вызываются в основном эпигенетическими изменениями, вряд ли можно будет использовать для моделирования заболеваний, если эти эпигенетические изменения не связаны с неизвестными генетическими нарушениями.

Перспективы применения тканевого инжениринга в моделировании болезней

На клетки влияют не только собственные клеточные программы, но и стимулы микроокружения, которые включают в себя соседние клетки, внеклеточный матрикс, факторы окружающей среды и физические силы [18]. Искусственные конструкции на основе биоматериалов, заселенные одновременно несколькими типами клеток, могут обеспечить эффективный способ создания более богатого внешнего окружения, полезного для изучения патологических межклеточных взаимодействий [45]. Эти внешние стимулы особенно важны для моделирования заболеваний, затрагивающих сложные взаимодействия нескольких типов клеток. Например, в процессе сокультивирования астроцитов с мутацией, вызывающей боковой амиотрофический склероз, и моторных нейронов дикого типа, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, обнаружено токсичное воздействие мутантных астроцитов на моторные нейроны [46].

Принимая во внимание, что полная реконструкция архитектуры ткани остается труднодостижимой задачей тканевой инженерии, меньшие функциональные единицы (10–100 мкм) уже были сконструированы для изучения клеточных реакций на различные локальные стимулы. С.Н. Бхатиа и соавт. (2008) использовали легкую литографию, чтобы создать микроскопические кластеры клеток, в которых 500-микрометровые островки человеческих клеток печени были окружены фибробластами. Эти микрокластеры клеточных культур были проанализированы на наличие функций печени с помощью анализа профилей экспрессии генов, метаболизма, секреции специфических факторов печени, и восприимчивости к гепатотоксинам. В результате было показано, что гепатоциты в микрокластерах по своим свойствам более схожи с гепатоцитами в печени, чем обычная культура гепатоцитов [47].

Такие подходы также могут быть применены в трехмерных конструктах, которые получают из коллагена, синтетических биоматериалов и из натуральных внеклеточных матриксов, которые предварительно очищают от живых клеток [48]. Использование производных ИПСК в комбинации с биоматериалами, например, формирование микрокластеров клеток на трехмерных матриксах, могло бы заполнить промежуток между традиционными клеточными культурами и животными моделями.

Заключение

Создание клеточных моделей большинства болезней человека – это большой и долгосрочный проект. По всей видимости, потребуются многие годы, чтобы адекватно решить существующие задачи для широкого круга заболеваний. Однако уже достигнут определенный прогресс в моделировании некоторых заболеваний. Применение таких моделей уже позволило найти малые молекулы – кандидаты для лечения семейной дизавтономии [36] и спинальной мышечной атрофии I типа [19]. Более того, модели болезней человека на основе ИПСК позволили продвинуться в изучении некоторых нейродегенеративных заболеваний [36, 37]. Клеточные модели на основе ИПСК выглядят особенно полезными в отношении орфанных заболеваний, для которых не существует моделей на животных и количество носителей болезни невелико. Для более сложных заболеваний можно ожидать синтез достижений в исследовании индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и конструировании тканей.

Разница между плюрипотентными и индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками

Основное различие между плюрипотентными и индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками заключается в том, что плюрипотентные клетки являются недифференцированными материнскими клетками (от эмбрионов и т.д.), которые обладают естественной способностью дифференцироваться в различные типы клеток, тогда как индуцированные плюрипотентные стволовые клетки являются соматическими взрослыми клетками, которые был и генетически перепрограммированы, чтобы показать характеристики, сходные с естественными плюрипотентными стволовыми клетками.

Стволовая клетка — это недифференцированная клетка, которая обладает уникальной способностью развиваться в разные или специализированные клетки. Кроме того, стволовые клетки бывают трех типов: унипотентные, плюрипотентные и мультипотентные. Если стволовая клетка может дифференцироваться в одну, множественную и во все типы клеток, она известна как унипотентная, мультипотентная или плюрипотентная стволовая клетка соответственно. Среди вышеупомянутых трех типов плюрипотентные стволовые клетки важны, поскольку они могут дифференцироваться во все типы клеток. Плюрипотентная эмбриональная стволовая клетка может развиться в целое человеческое существо.

Содержание
  1. Обзор и основные отличия
  2. Что такое плюрипотентные стволовые клетки
  3. Что такое индуцированные плюрипотентные стволовые клетки
  4. Сходство между плюрипотентными и индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками
  5. В чем разница между плюрипотентными и индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками
  6. Заключение
Что такое плюрипотентные стволовые клетки?

Плюрипотентные стволовые клетки являются недифференцированными мастер-клетками, которые способны дифференцироваться в первичные три слоя эмбриональных клеток (эктодерма, энтодерма и мезодерма). Они способны самообновляться и дифференцироваться в любой тип клеток организма. «Эмбриональные стволовые клетки» — это общий термин, используемый для обозначения плюрипотентных стволовых клеток. Клетка, которая происходит от эмбриона, может производить почти все типы клеток в нашем организме. Однако после определенного этапа эти клетки теряют свою плюрипотентность. Как только они теряют его, они становятся определенным или специфическим типом клеток, которые не могут быть дифференцированы в дальнейшем. Когда плюрипотентные стволовые клетки культивируются в лаборатории, их называют «плюрипотентными линиями стволовых клеток».

Плюрипотентные стволовые клеткиПлюрипотентные стволовые клетки

Существует несколько типов плюрипотентных стволовых клеток. Среди них наиболее важны эмбриональные стволовые клетки. Кроме того, эти клетки очень важны в терапии заболеваний, поскольку их можно использовать для производства здоровых клеточных масс или тканей для замены пораженных тканей (трансплантация).

Что такое индуцированные плюрипотентные стволовые клетки?

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (induced pluripotent stem, iPS) являются вторым типом плюрипотентных стволовых клеток. Это перепрограммированные клетки. Они происходят из соматических взрослых клеток. Их гены перепрограммированы, чтобы превратить их в природные плюрипотентные стволовые клетки и пройти путь нормального дифференцирования. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки обладают большим терапевтическим потенциалом. А также они помогают изучать, как развиваются различные заболевания и как их лечить. Кроме того, они устраняют проблемы с подбором и отторжением тканей во время трансплантации.

Индуцированные плюрипотентные стволовые клеткиИндуцированные плюрипотентные стволовые клетки

Производство индуцированных плюрипотентных стволовых клеток следует тщательно проводить в лаборатории. Кроме того, большинство из них происходят от соматических клеток, таких как клетки кожи или другие клетки организма. В процессе производства участвуют несколько генов.  Для введения этих генов в соматические клетки, используются вирусные и невирусные методы.

Каковы сходства между плюрипотентными и индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками?
  • Как плюрипотентные, так и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки являются недифференцированными клетками.
  • Они могут самообновляться бесконечно при выращивании.
  • Как плюрипотентные, так и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки могут дифференцироваться в клетки любого типа в организме.
В чем разница между плюрипотентными и индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками?

Как плюрипотентные, так и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки являются недифференцированными клетками, которые могут дифференцироваться в клетки любого типа. Следовательно, ключевое различие между плюрипотентными и индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками заключается в том, что плюрипотентные стволовые клетки являются естественными эмбриональными клетками, тогда как индуцированные плюрипотентные стволовые клетки являются перепрограммированными соматическими клетками.

Заключение — Плюрипотентые против индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Эмбриональные стволовые клетки и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки представляют собой два типа плюрипотентных стволовых клеток. Оба имеют способность дифференцироваться в любые типы клеток. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки представляют собой перепрограммированные или генетически модифицированные соматические клетки. Они показывают такой же различный потенциал, что и эмбриональные клетки. Обе клетки имеют большое терапевтическое значение при лечении заболеваний.

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки — MoiKompas.ru


Для возможной терапии различных заболеваний с помощью iPS-клеток, необходимо решить несколько проблем, включающих избавление от рисков и недостатков существующего ныне метода генетического преобразования клеток и низкой эффективности и медленной кинетики индукции. Авторы статьи A Combined Chemical and Genetic Approach for the Generation of Induced Pluripotent Stem Cells (смю ниже) выяснили, что нервные прогениторные клетки (НПК — клетки предшественники, близки к стволовым) могут быть перепрограммированы с помощью меньшего числа генетических манипуляций по сравнению с ранее использованными соматическими клетками, а также что маленькие молекулы могут заменить вирусное взаимодействие определенных факторов транскрипции и способствовать процессу пеерпрограммирования.
НПК, которые экспрессируют Sox2 эндогенно, были перепрограммированы после трансфекции только лишь Oct3/4 и Klf4, и из них получили колонии iPS-клеток.

Было обнаружено, что малая молекула BIX-01294, ингибитор G9a гистон метилтрансферазы (Kubicek, S., O’Sullivan, R.J., August, E.M., Hickey, E.R., Zhang, Q., Teodoro, M.L., Rea, S., Mechtler, K., Kowalski, J.A., Homon, C.A., et al. (2007). Mol. Cell 25, 473–481), может увеличить эффективность перепрограммирования НПК, трансфецированных только Oct3/4-Klf4, до уровня, сравнимого с трансфекцией всех четырех факторов.

Из результатов, представленных Yan Shi можно сделать следующие выводы: уровни эндогенной экспрессии генов, необходимых для репрограммирования некоторых ткане-специфичных соматических клеток могут быть достаточными для замены вирусной трансдукции экзогенных генов и получения iPS-клеток. Однако в работе использовались НПК зародыша, взрослые клетки могут не обладать такой способностью.
Использование малых молекул может снизить вероятность возникновения раковых опухолей и обеспечить эффективное и безопасное перепрограммирование.

Marson (группа Рудольфа Джениша) показал в своей статье, что растворимый Wnt3a способствует перепрограммированию iPS-клеток в отсутствие c-Myc ретровируса. Эти данные демонстрируют, что сигнальные пути трансдукции и транскрипционные факторы могут работать заодно при перепрограммировании дифференцированных клеток в плюрипотентное состояние.
Сигнальный путь Wnt вносит вклад в поддержание плюрипотентности в эмбриональных стволовых клетках мыши и человека (Sato et al., 2004; Ogawa et al., 2006; Singla
et al., 2006; Cai et al., 2007)

Весьма вероятно, что Wnt или малые молекулы, которые регулируют сигналлинг Wnt, окажутся весьма полезными, наряду с другими временными сигналами, которые еще предстоит определить, для полного избавления от оставшихся ретровирусов.

Влияние неспецифических ингибиторов ДНК-метилтрансферазы и гистоновой
деацетилазы на эффективность репрограммирования эмбриональных
фибробластов мышей.

Успешная индукция iPS клеток из нейральных стволовых клеток с помощью комбинации двух факторов.

Дальнейшие открытия химических веществ и малых молекул, которые способствуют эпигенетическому перепрограммированию, в сочетании с усиленной активацией эндогенных генов перепрограммирования, могут претворить в жизнь генерацию iPS-клеток без ретровирусного вмешательства. Это сделает возможным безопасное создание человеческих iPS-клеток для применения в клинической терапии, что сделает возможным избавление от старения и других болезней.

Yan Shi, Jeong Tae Do, Caroline Desponts, Heung Sik Hahm, Hans R. Scho¨ ler, and Sheng Ding «A Combined Chemical and Genetic Approach for the Generation of Induced Pluripotent Stem Cells»

Alexander Marson, Ruth Foreman,Brett Chevalier, Steve Bilodeau, Michael Kahn, Richard A. Young and Rudolf Jaenisch «Wnt Signaling Promotes Reprogramming of Somatic Cells to Pluripotency»

Takashi Tada «Genetic Modification-free Reprogramming to Induced Pluripotent Cells: Fantasy or Reality?»

Плюрипотентные стволовые клетки в психиатрии

 

Клеточные модели нарушений развития нервной ткани представляют собой ценную экспериментальную систему для изучения механизмов заболевания и поиска терапевтических стратегий. Развитие мозга млекопитающих – достаточно запутанный процесс. Отклонения в таком процессе приводят к изменению нервных контуров, возникновению когнитивных и поведенческих проблем. Огромное количество генов, вовлеченное в развитие подобных заболеваний, и их дифференциальная экспрессия в разных типах клеток осложняет выбор экспериментальной модели. 

 

Открытие человеческих эмбриональных стволовых клеток (чЭСК) в конце 1990-х и человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) в 2007 дало новые возможности для изучения человеческого развития и моделирования болезней. 

 

С тех пор были предприняты огромные усилия для того, чтобы воспроизвести развитие нервной ткани: дифференцировка стволовых клеток в специализированные субпопуляции, перепрограммирование соматических клеток, создание ресурсов для скрининга лекарств. Большинство исследований сосредоточены на создании моделей именно нейронов для нарушений развития нервной ткани. Однако Lee и соавторы полагают, что необходимы исследования и тех стволовых клеток, которые не относятся к нейрональному пулу. Они сделали обзор исследований, в которых создаются модели для развития различных типов клеток мозга при расстройствах аутистического спектра (РАС), синдроме Ретта, биполярном расстройстве и шизофрении.

 

Нарушения развития нервной ткани очень сложны для моделирования по ряду причин. Во-первых, в связи с наличием в мозге запутанной сети взаимодействий, обеспечивающих появление конкретного фенотипа заболевания. Во-вторых, подобные нарушения могут быть вызваны целым рядом сочетаний и вариантов экспрессирующихся генов, вклад которых нелегко оценить. Традиционные методы получения клеток также имеют свои недостатки: неоптимально в данном случае использование ткани, полученной в результате биопсии или посмертно: в данном случае не удается корректно проследить течение и развитие заболевания. Кроме того, неясно, какой вклад в наблюдающиеся процессы и изменения вносят медикаменты, полученные пациентом. Животные в качестве модели также вызывают большие вопросы в силу специфичности (масса мозга, объем коры и ее пространственная структура) и малой исследованности человеческого мозга. Поэтому альтернатива, например, использование иПСК, так необходима.

 

 

РАС – это характерное для детей нарушение развитие нервной ткани, на формирование которого оказывают влияние как генетические, так и средовые факторы. При этом генетический вклад весьма значим, кроме того, его часто обуславливают варианты, появляющиеся de novo. В основе заболевания лежат нарушения иммунной регуляции, связей между нейронами и генетические дефекты некоторых белков синапса. Для РАС был проведен ряд исследований с использованием иПСК, в том числе, позволившие обнаружить de novo варианты, обусловившие развитие РАС у пациента. Для этого клетки пульпы зуба пациента были перепрограммированы в иПСК и затем дифференцированы в нейроны, продемонстрировавшие фенотип с отклонениями. Отклонения удалось показать и для астроцитов от других пациентов (без синдромов). Эти астроциты характеризовались повышенным уровнем воспалительных цитокинов, а нейроны, в свою очередь, были менее физиологически активными, чем контрольные. При совместном культивировании дефектных астроцитов с нормальными нейронами, нормальные нейроны демонстрируют фенотип, характерный для нейронов пациентов с РАС. Любопытно, что если заменить астроциты на нормальные, то состояние нейронов снова улучшится. Это показывает, что воспаление в астроцитах может влиять на функции нейронов и вносить вклад в патогенез РАС.

 

Кроме двумерных клеточных моделей РАС, так же используются трехмерные модели органоидов. Mariani и коллеги создали органоидную систему, которая включает слои радиальной глии, промежуточные слои и нейроны из человеческих иПСК на ранних стадиях развития. Однако подобные системы все еще требуют доработки, особенно с учетом того, что еще не все возможные клеточные фенотипы РАС известны.

 

 

Синдром Ретта – достаточно редкое Х-хромосомное нарушение развития нервной ткани, которое характеризуется нормальным ростом в раннем возрасте с постепенным медленным снижением или резкой потерей языковых и моторных навыков. Синдром Ретта вызывается мутациями в гене транскрипционного репрессора метил-CpG-связывающего белка 2 (МеСР2) на Х-хромосоме. Были созданы линии иПСК, взятые от пациентов с синдромом Ретта и дифференцированы в предшественники нейрональных клеток и функциональные нейроны. Эти нейроны характеризовались сниженным числом дендритом и синапсов в сравнении с контрольными нейронами, а также некоторыми электрофизиологическими нарушениями.

 

Исследовались также глиальные эффекты для синдрома Ретта: например, в исследовании Williams и коллег. Они обнаружили дефекты в росте нейронов, совместно культивируемых с астроцитами от пациентов с синдромом Ретта. Эти нейроны демонстрировали уменьшенный размер тела, укороченную длину аксонов и меньшее число терминалей. Данные результаты заставляют задуматься о смене стратегий лечения синдрома Ретта с ориентированных исключительно на нейрональную активность и синаптическую передачу и учитывать влияние астроцитов.

 

 

Биполярное расстройство – хроническое заболевание, характеризующееся меняющимися эпизодами мании и депрессии, которые могут длиться от нескольких дней до нескольких месяцев. В некоторых случаях расстройство приводит к самоубийству. Во многих исследованиях отмечалась пониженная плотность глии в передней поясной извилине коры и сниженное количество астроцитов и олигодендроцитов в гиппокампе и префронтальной коре у пациентов с биполярным расстройством. 

 

Mertens и коллеги обнаружили митохондриальные нарушения в нейронах, полученных из иПСК от пациентов с биполярным расстройством и на этой же модели идентифицировали более тысячи генов, экспрессия которых менялась в сравнении с экспрессией генов нормальных нейронов. Эти различия вызывают изменения в электрохимической активности и приводят к чрезмерной возбудимости клеток, которую исследователям, однако, удалось обратить благодаря использованию лития. Таким образом, подходы с использованием иПСК позволяют не только изучать механизмы, но и искать возможные варианты лечения для биполярного расстройства.

 

 

Шизофрения – расстройство развития нервной ткани, характеризующееся широким спектром симптомов, включающих бред, галлюцинации, нарушения эмоционального и социального поведения. Генетический вклад в появление заболевания очень существенен: наследуемость оценивается в 80-85%. Считается, что шизофрения связана с нарушениями связей между нейронами, кроме того, отмечается важная роль олигодендроцитов и клеток-предшественников, у которых присутствуют изменения в морфологии, экспрессии генов и плотности. Кроме того, нарушается миелинизация.

 

Robicsek и соавторы использовали для моделирования иПСК, полученные из нейронов пациентов с шизофренией. Эти иПСК  демонстрировали нарушение дифферецировки в дофаминергические клетки-предшественники, сниженное число и длину аксонов, а также пониженную экспрессию ряда маркеров зрелых нейронов (тирозингидроксилазы, синаптического транспортера дофамина), митохондриальную дисфункцию в процессе дифференциации и созревания.

 

Недавно было проведено исследование с использованием химерной мыши с глией с фенотипом шизофрении. Чтобы получить таких мышей, была проведена неонатальная трансплантация клеток от пациента с шизофренией для мыши с нарушением, связанными с дефицитом миелина. В целом эта система позволила показать наличие дефектов при миграции незрелых клеток, что и приводит к характерным для шизофрении снижению количества белого вещества и гипомиелинизации в коре. Трансплантированные астроциты, полученные из иПСК с фенотипом шизофрении демонстрировали нарушенную морфологию, более медленное созревание, что может оказывать эффект на формирование нервных контуров и миелинизацию, так как эти процессы направляются астроцитами. Нарушения в созревании глии напрямую приводят к нарушению поведения у таких химерных мышей, которое соответствует поведенческим патологиям у людей. Стоит отметить, что такая модель все же не идеальна в силу различий генетического фона и развития мыши и человека.

 

 

Использование перепрограммирования иПСК достаточно сильно изменило исследования. Стал возможным высокоэффективный  поиск новых лекарств и моделирование их влияния (новый термин – pharmaco-iPSCCellomics). Кроме того, такие клетки можно трансплантировать in vivo, что уже было опробовано на модели болезни Паркинсона у приматов. Это очень привлекательный способ лечения и для людей, однако стоит помнить о том, что каждый пациент требует персонального подхода в создании трансплантата, а также существуют риски развития опухолей.

 

В свою очередь, органоидные системы позволяют изучать взаимодействия между клетками и создавать достаточно точные модели, вплоть до самоорганизующегося трехмерного кортикального органоида с различными уровнями клеток и апико-базальной полярностью.

 

Однако следует помнить и о ряде ограничений. Одно из самых больших – малые размеры выборок, которые могут приводить к ошибочным результатам. Кроме того, показано, что эпигенетические различия между клеточными линиями от одного и того же пациента могут бы значимыми. Предполагается, что они появляются из-за методологических особенностей трансфекции и могут индуцировать онкогенный стресс. Также иПСК могут сохранять эпигенетическую “память”, которая может влиять на получаемые эффекты. Кроме того, многие заболевания имеют сложную генетическую природу, при которой разные люди могут нести разные генетические комбинации.

 

Автор перевода: Колодяжная А.

 

Источник: Lee, K.M., Hawi, Z.H., Parkington, H.C. et al. The application of human pluripotent stem cells to model the neuronal and glial components of neurodevelopmental disorders. Mol Psychiatry 25, 368–378 (2020).

 

Читайте также:

Стволовые клетки | Cell Biology.ru

Cтволовые клетки классифицированы в соответствии со своей возможностью к дифференцировке как тотипотентные, плюрипотентные и мультипотентные.
Тотипотентные — клетки, способные дифференцироваться в любые клетки организма. Как из одной оплодотворенной клетки вырастает целый организм.
Плюрипотентные — клетки, способные образовывать множество различных клеток, но не целый организм.
Мультипотентные — клетки, способные образовывать клетки тканей из которых они были взяты.
Унипотентные — клетки дающие начало только одному типу клеток.
Клетки развивающегося эмбриона изначально тотипотентны, но теряют это свойство после нескольких клеточных делений, т.е. они дифференцируются. Некоторые из клеток организма, не дифференцируются окончательно, а становятся плюрипотентными, т.е. способны давать лишь некоторые типы клеток целого организма. Тотипотентные клетки эмбриона называют
так же — эмбриональные стволовые клетки (ESC), а плюри- и мультипотентные клетки организма называют — взрослыми стволовыми клетками. Функция первых в организме очевидна, из одной клетки должен развиться целый организм с огромным числом клеточных типов (~200 у человека), каждый из которых выполняет свою функцию. Взрослые стволовые клетки необходимы организму для восполнения погибших клеток в процессе жизни. Взрослые стволовые клетки способны заменять практически все ткани в организме: мозг, костный мозг, кровь, почку, эпителий пищеварительной системы, кожу, сетчатку, мышцы, поджелудочную железу и печень.
Взрослые стовловые клетки способны к самоподдержанию и производству клеток -предшественников, которые затем дифференцируются.

Гематопоэзные стволовые клетки (HSC)

Клетки способные производить все клетки крови находятся в крастном костном мозге. Клетки из которых образуются клетки крови имеют на своей поверхности маркеры CD34, CD59 и Thy1,
по которым могут быть идентифицированы.

Нейральные стволовые клетки (NSC)

Нейрогенез в мозге происходит в двух местах: субвентрикулярная зона (СВЗ), из которой были изолированы первые с.к., и зубчатая извилина. Зрелые нейроны образуются в обонятельной луковице , область в которую мигрируют клетки из СВЗ различными путями называемыми ростральной миграционной системой. СВЗ содержит эпиндимальные клетки и астроциты со схожей ролью с клетками стромы в костном мозге. Эпидимальные клетки и астроциты образуют каналы называемые глиальные трубки по которым происходит миграция нейробластов к обонятельной луковице, где дифференцируются в перигломерулярные или гранулярные нейроны, которые выстраиваются цепочкой. Астроциты в трубках обеспечивают питание клеток.

Известны молекулярные маркеры, позволяющие идентифицировать как стволовые нервные клетки, так и последовательные фазы их развития, — это нестин для ство-ловой клетки, виментин для клетки-предшественника, бета-тубулин для нейробласта,
GFАР (кислый глиальный фибриллярный белок) для клетки, «движущейся» в направлении глиального развития и т. д.
Установлено, что нервные стволовые клетки характеризуются выраженным консерватизмом, так что человеческие стволовые клетки способны мигрировать и развиваться в случае их трансплантации в мозг крысы. Более того, в экспериментах было показано, что даже нервные стволовые клетки дрозофилы способны дифференцироваться в случае их ксенотрансплантации в мозг такого отдаленного таксона, как крыса. Для этой цели были получены трансгенные линии дрозофилы, содержащие человеческие гены, кодирующие нейротрофические факторы NGF, GDNF, BDNF. Человеческие гены были встроены в вектор Саsреr под дрозофилиным хит-шоковым промотором, так что температура тела млекопитающих служила автоматическим активатором соответствующих генов. Для идентификации клеток дрозофилы в геном трансгенных линий был введен ген бактериальной галактозидазы 1асZ, продукт которого легко
выявляется с помощью гистохимической Х-гал окраски. Тем самым нервные клетки ксенотрансплантата легко обнаруживаются среди клеток реципиента или котрансплантата. Оказалось, что нервные стволовые клетки дрозофилы не только выживают, но и мигрируют и дифференцируются в мозге крысы.

Мышечные стволовые клетки (MSC)

Обонятельные стволовые клетки

Дают начало обонятельным клеткам. Располагаются в слизистой носа.

Стволовые клетки печени

В нормальном состоянии клетки печени деляться очень медленно, но под влияниям повреждений или инфекции пролиферация клеток усиливается многократно. Имеется 3 популяции клеток, способных востановить печень.

Эмбриональные стволовые клетки (ESC)

Эмбриональные стволовые клетки получают из внутренней клеточной массы бластоциста от оплодотворения яйцеклетки до ее имплантации, при этом бластоциста
мыши достигает 150 клеток и представляет собой сферу с внешним слоем клеток, полостью бластоцеля заполненной жидкостью и внутренней клеточной массой.
ESC человека могут быть получены пересадкой ядер, называемой так же терапевтическое клонирование. При пересадке ядра соматической клетки донора (например в клетку кожи) в яйцеклетку с удаленным ядром, образуется бластоциста, клетки которой тотипотентны. Стволовые клетки полученные таким образом не отвергаются при пересадке.
ESC могут быть получены из примордиальных клеток из которых образуются яйцеклетки и сперматозоиды.
Классическими маркерами ЭСК являются изозимы щелочной фосфатазы, транскрипционный фактор Осt-4, высокая теломеразная активность и ряд маркеров клеточной поверхности, например GСТМ-2, TRA 1-60, SSЕА-3 и SSЕА-4, распознаваемые моноклональными антителами к специфическим эмбриональным или опухоль-определяющим антигенам. Физиологическое значение большинства маркеров остается неясным,
за исключением Осt-4. Исследования, проведенные на ЭСК и эмбрионах мыши, выявили критическую роль Осt-4 в поддержании тотипотентности ранних эмбриональных клеток и клеток зародышевого пути. Дифференцировка клеток внутренней массы сопровождается понижением уровня Осt-4, а изменение уровня синтеза Осt-4 в ЭСК в свою очередь приводит к потере тотипотентности и переходу к дифференцировке. Кроме Осt-4, имеется еще ряд транскрипционных факторов, синтезируемых в основном недифференцированными ЭСК, например Nanog, который занимает важное место в иерархии факторов, определяющих недифференцированную природу ЭСК, и происхождение.

Маркеры стволовых клеток

Гены «стволовости»

Повышенная экспрессия в стволовых клетках регуляторных генов, таких как НохВ4, Неs-1 или AMLI-ETO приводит к размножению стволовых клеток in vitro и in vivo.

Лечение стволовыми клетками

Первое клиническое применени стволовых клеток началось еще до их открытия. При переливании крови в организм реципиента
попадают стволовые клетки донора, которые внедряются в организм реципиента и дифференцируются. При лейкозах (рак крови) широко применяют обильное переливание крови и пересадку костного мозга — вводят в организм клетки, дающие начало всем клеткам крови. В результате образуются нормальные, не пораженные раком лейкоциты и лимфоциты, что улучшает состояние пациента. К сожалению, при переливании крови или пересадке ткани костного мозга от одного человека к другому может наблюдаться реакция отторжения. Ее пытаются минимизировать, подбирая донора, антигенная структура белков которого сходна с таковой у реципиента. Используют также лекарства, подавляющие иммунный ответ последнего. Однако это может быть опасно, ибо иммунная система обеспечивает очищение организма от инфекционных агентов и время от времени возникающих в нем клеток с измененным геномом; тогда отдельные из них могут малигнизироваться (т.е. превратиться в раковые). Решить проблему тканевой несовместимости можно, вероятно, используя
для пересадки стволовые клетки самого пациента, размноженные вне организма. Очень важно то, что стволовые клетки почти не подвержены злокачественному перерождению, поскольку обладают системой зашиты генома значительно более мощной, чем вступившие на путь специализации. Вот почему ныне из костного мозга больных лейкозом выделяют стволовые клетки и консервируют их в жидком азоте. Затем собственный костный мозг, включая содержащиеся в нем опухолевые клетки, подавляют облучением или цитостатиками (лекарствами, блокирующими рост и размножение клеток), после чего восстанавливают кроветворение и иммунитет, пересаживая сохраненные в азоте стволовые клетки, из которых образуется полный набор нормальных клеток крови. Такую замену производят не только при лейкозах, но и при других опухолях, если лечение включает курсы радио- или химиотерапии.
В настоящее время для каждого рождающегося человека может быть создан запас стволовых клеток, по свойствам близких к эмбриональным и генетически тождественных всем его другим
клеткам. Для этого при родах нужно собирать содержащую их пуповинную кровь и хранить ее (или выделенные из нее клетки) в жидком азоте вплоть до момента, когда она понадобится для пересадки.

Лечение заболеваний сердца

Инфаркт миокарда вызывается спазмом или закупоркой артерий, питающих мышцу сердца. Пораженные сосуды удаляют, а для восстановления кровообращения применяют шунтирование. Однако это не обеспечивает восстановление погибшего участка сердечной мышцы. Если зона инфаркта обширна, то сократительная функция сердца значительно страдает, и больной не может вести нормальный образ жизни. Пересадка препаратов стволовых клеток, полученных из его костного мозга, а также производных эмбриональных или фетальных клеток путем вливания их суспензии в общий кровоток или инъекцией непосредственно в миокард по границе зоны омертвления мышцы (последнее делается в процессе шунтирования) приводит к частичному или полному восстановлению структуры и функции миокарда и значительно улучшает качество жизни
больного.

Лечение заболеваний костной системы

Введение полученных из стволовых клеток остеобластов (предшественники клеток кости) в зону перелома значительно ускоряет процесс сращивания кости, а введение хондробластов (предшественники клеток хряща) в суставную сумку стимулирует регенерацию хряща на суставных поверхностях.

Лечение рака

Stem cells have acquired a golden glow in the past few years
as a possible tool for reversing the damage of various organs.
The prediction was that stem cell transplants, whether derived
from embryonic tissue or from adult cells that retain
the fl exibility to develop into various tissues, will someday
repair hearts crippled by heart attacks or brains under attack
by Alzheimer’s or Parkinson’s disease. But the very qualities
that make these cells so attractive to medicine, especially
their capacity to replicate ad infi nitum, also hint at a
dark side. Evidence suggests that they may be the source of

the mutant cells that give rise to cancerous tumors (also reviewed
in [115]. In studies of cells in blood cancers such as
leukemia and in breast and brain cancers, cells called “cancer
stem cells” have been identifi ed. The fi ndings have raised
the possibility that the mutations that drive cancer development
may have originated in the body’s small supply of naturally
occurring stem cells. Cancer stem cells resemble these
normal cells in several ways. In particular, both types are selfrenewing.
Thus, when they divide, one of the daughter cells
differentiates into a particular cell type that eventually stops
dividing, but the other retains its stem cell properties, including
the ability to divide in the same way again. Therefore,
it is possible that cancer stem cells, which form only a small
proportion of the total tumor cell population, are the only
tumor cells with the capacity to keep tumors growing.

In the early 1990s, Dick and colleagues [116,117] used a
model to study the development of human hematopoietic
stem cells which give rise to various types of blood cells. The
model is based on an extremely immunodefi cient mouse
strain, the NOD/SCID mouse. The animals were irradiated
to destroy their bone marrow and then human stem cells
were introduced to see if they would produce a new complement
of blood cells. After showing that normal human
hematopoietic stem cells could do this, Dick and his team
used the approach to study the cancer-causing power of
acute myeloid leukemia (AML) cells freshly harvested from
human patients [118]. By a progressive dilution of a known
number of leukemia cells, it was possible to establish that
only a very rare AML cell, about one in a million, had the
ability to reproduce the disease in the animals. Because this
was a much smaller fraction of cells than that necessary to

form colonies in culture, the result indicated that the simple
ability to grow did not equate with the ability to develop
into leukemia in living animals. Thus one could speculate
that the leukemia-initiating cells had a greater developmental
potential than the vast majority of clone-forming cells
and might even be stem-like cells. Subsequently, the leukemia-
initiating cells were characterized according to surface
protein markers that distinguish the various cell types of the
hematopoietic system. The leukemia-initiating cells turned
out to belong to an exclusive group. They were positive for
the CD34 marker and negative for CD38, the same as human
hematopoietic stem cells, and did not carry the markers
of more mature cells. The cancer cells’ resemblance to
normal stem cells holds up even though AML is a heterogeneous
disease, with several different subtypes depending
on which genetic abnormalities the patients’ cells carry.

Dick and his colleagues characterized the leukemia-initiating
cells from the various AML subtypes and found that all
belonged to that same CD34+/CD38– class. When put into
NOD/SCID mice, however, each cell type produced a leukemia
identical to that in the patient from which it had originally
been isolated. A plausible conclusion from this study
is that the initial mutations that gave rise to the leukemias
arose in normal stem cells, causing them to take the wrong
developmental pathway.
Another line of evidence suggesting that cancers originate
from stem cells comes from studies of the biological machinery
underlying self-renewal. Normal and cancer stem
cells show some striking similarities. Recently, for example,
researchers have shown that the genes Bmi-1 and Wnt, both
of which can cause cancer when mutated, are needed for
self-renew in normal and cancer stem cells (also reviewed
in [119]. The Bmi-1 gene participates in normal hematopoietic

development, and its malfunction has been linked to
AML. A study reported by Park and collaborators [120] and
another by Lessard and Sauvageau [121] link the gene to
self-renewal. To test whether cells missing Bmi-1 can selfrenew,
the researchers transplanted stem cells from Bmi-1
knockout mice into normal mice that had been irradiated
to destroy their bone marrow. The stem cells produced a
normal complement of blood cells, but only for very short
period of time. After eight weeks, blood cells derived from
the transplanted cells had almost disappeared, and when
bone marrow taken from the animals was put into a second
series of mice, no Bmi-1-defi cient blood cells could be detected.
Bmi-1 is also needed for the self-renewal of leukemia
cells [121]. In previous reports, Sauvageau and collaborators
revealed that they could cause an AML-like disease
in mice by introducing two oncogenes, Meis1a and Hoxa9,

into the bone marrow cells of the animals [122]. This result
shows that without Bmi-1, leukemia stem cells die out,
just as normal stem cells do. The Wnt gene is likewise the
focus of a great deal of research by both cancer researchers
and developmental biologists. The protein encoded by the
gene normally controls cell fate decisions during the development
of many of the body’s tissues. It exerts its effects by
binding to, and thus activating, a receptor on the cell surface
membrane. This in turn sets off a series of changes inside
the cell, culminating in the activation of genes governing
cell division and differentiation. Details of these processes
however, are still poorly understood and require further
intensive research both in the area of stem cells, including
lessons learned from the biology of embryonic stem cells,
as well as from the biology of various cancer cell lines and
various types of cancer.

Лечение заболеваний нервной системы

Сокращения.
in vivo — в живом организме
in vitro — в пробирке

Лечение стволовыми клетками в Германии

Еще недавно считалось, что клетки могут развиваться только в одном направлении: из стволовых клеток получаются дифференцированные (специализированные) клетки, и обратного пути нет. Как оказалось, это не так. Зрелые клетки могут быть перепрограммированы в плюрипотентное состояние. За это открытие Джон Гардон и Шинья Яманака в 2012 году получили Нобелевскую премию.

Плюрипотентность – это возможность развития по разным сценариям. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки получают из зрелых клеток. Они могут развиться в любые ткани человеческого организма при соблюдении определенных условий. Получение индуцированных стволовых клеток из кожи человека открывает перед медициной новые возможности. Ведь с их помощью становится реальным выращивание и пересадка органов и тканей.

Плюрипотентные стволовые клетки – отличная альтернатива эмбриональным стволовым клеткам. Их использование противоречит этическим нормам многих людей. В отличие от эмбриональных, индуцированные стволовые клетки происходят не из эмбриона. Их получают из клинического материала, взятого с тела человека, обычно из кожи.

В настоящее время во всех развитых странах мира ведутся исследования, направленные на поиск новых методов лечения различных заболеваний при помощи индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Большинство из них проводятся на лабораторных животных или культурах клеток. Но некоторые методы терапии уже перешли в фазу клинических испытаний.

Компания Booking Health предлагает следующие программы лечения стволовыми клетками: 

 

Стволовые клетки(c) shutterstock

 

Лечение слепоты стволовыми клетками

Заболевания сетчатки – самая опасная для зрения группа патологий. Ведь она приводит к необратимой слепоте. Существующие на сегодняшний день методы лечения не позволяют восстанавливать полноценное зрение у таких пациентов. Поэтому большие надежды возлагаются на клеточную терапию.

Попытки лечения сетчатки глаза стволовыми клетками начались относительно недавно. Впервые сетчатка была выращена в Японии, в 2011 году. Вначале исследователи получили трехмерную структуру сетчатки мышей, а затем и человека. Но она не реагировала на свет.

В 2013 году ученым из США удалось создать функционирующую сетчатку. Для этого клетки предшественники рецепторов сетчатки были получены из перепрограммированных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Они образовали сложную структуру, состоящую из 7 типов клеток, включая 6 типов нейронов. На поверхности сетчатки содержались фоторецепторы, реагирующие на свет.

В 2014 году в Японии провели пересадку клеток сетчатку человеку. Она была выращена из собственных индуцированных стволовых клеток. Но вторая операция была отменена из-за обнаружения генетических аномалий в культуре клеток. Основная причина – пожилой возраст пациентов. Исследования были приостановлены.

В 2015 году журнал Stem Cells опубликовал результаты исследования, в котором ученые использовали стволовые клетки для лечения макулодистрофии. Это необратимое поражение сетчатки, при котором у человека сохраняется только периферическое зрение. Замедлить его развитие препаратами невозможно. Но инъекции прогениторных стволовых клеток, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, позволили сохранить зрение у крыс в течение 130 дней, что для человека, с учетом средней продолжительности жизни, эквивалентно 16 годам. Здоровые клетки после инъекции мигрировали в сетчатку. Они формировали защитный слой и предотвращали дегенерацию еще сохранившихся клеток.

В 2016 году Исследователи из Университета Кардиффа сумели вырастить ткани хрусталика, роговицы и конъюнктивы. Для этого использовались человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. Кроликам с искусственно вызванной слепотой проводилась трансплантация в глаз выращенных тканей. В результате у подопытных животных восстанавливалось зрение.

В начале 2017 года было опубликовано исследование, в котором ученые произвели мышам трансплантацию сетчатки, выращенной из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Впервые для пересадки были использованы дифференцированные ткани сетчатки. После операции фоторецепторы сформировали связи с клетками структур глаза. В результате был получен ответ на стимуляцию светом через 1 месяц после трансплантации. У половины мышей с конечной стадий дегенерации сетчатки было отмечено частичное восстановление зрения.

В марте 2017 года было произведено восстановление сетчатки стволовыми клетками человеку с макулодистрофией. В отличие от предыдущих операций, сетчатка была выращена из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток донора. Операция прошла успешно. Всего планируется 5 таких трансплантаций в рамках проводимого исследования. За пациентом ведется наблюдение. Окончательные результаты пересадки клеток сетчатки пока что не опубликованы. В случае успешного внедрения метода лечения макулодистрофии планируется создать банк готовых индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.

Лечение мозга стволовыми клетками

Как известно, нервные клетки не восстанавливаются. По крайней мере, так было до того, как начала активно развиваться клеточная терапия. На сегодняшний день лечение головного мозга стволовыми клетками постепенно превращается из фантастики в реальность. Многие заболевания, которые ранее считались неизлечимыми, совсем скоро отступят перед неудержимым натиском современной медицины.

Лечение болезни Альцгеймера стволовыми клетками

Немало усилий исследователи направляют на поиск эффективных методов лечения болезни Альцгеймера стволовыми клетками. Патология сопровождается постепенным отмиранием функциональных нейронов. Они перерождаются в реактивные глиальные клетки.

Лечение Альцгеймера стволовыми клетками имеет огромный потенциал. Рубец из глиальных клеток ограничивает рост функциональных нейронов. Но в 2013 году было проведено исследование, которое показало возможность преобразования глиальных клеток в здоровые нейроны.

Лечение инсульта стволовыми клетками

Не только при болезни Альцгеймера лечение стволовыми клетками способно обеспечить положительный результат. Другие причины повреждения ткани мозга тоже рассматриваются в качестве направлений для дальнейших испытаний. Немалый интерес представляет лечение ишемического инсульта стволовыми клетками. Ведь это заболевание входит в число наиболее частых причин смерти человека.

Современные клеточные технологии позволяют перепрограммировать клетки ЦНС. Это было продемонстрировано в экспериментах на мышах, а также на культурах клеток человека. Превращение нейроглии в функциональные нейроны, которые погибают после инсульта, было успешным. Из плоских глиальных клеток выросли полноценные нервные клетки, с аксоном и дендритами (короткими и длинным отростками). Как оказалось, такие нейроны могут передавать импульсы и синтезировать нейромедиаторы.

Таким способом может проводиться лечение геморрагического инсульта стволовыми клетками. После кровоизлияния в головной мозг многие функции ЦНС нарушаются. Но исследователи уверены: пациенты снова смогут встать на ноги. Поможет в этом лечение последствий инсульта стволовыми клетками.

Лечение травм спинного мозга стволовыми клетками

На данном этапе развития медицины восстановление спинного мозга стволовыми клетками не представляется возможным. Но исследовательская деятельность в этом направлении ведется. Вполне вероятно, что скоро лечение спинного мозга стволовыми клетками станет реальностью.

В 2017 году было опубликовано исследование, в котором из стволовых клеток были получены так называемся интернейроны V2a. После их введения в спинной мозг мышей наблюдалось формирование межнейрональных связей между мотонейронами. Восстанавливались пути передачи сигнала от нервов к конечностям.

Лечение бокового амиотрофического склероза стволовыми клетками

Данное направление исследовательской деятельности дает надежду не только пациентам после травм спинного мозга. Вполне вероятно, что скоро станет возможным лечение стволовыми клетками бокового амиотрофического склероза. Это неизлечимое заболевание, при котором происходит гибель мотонейронов. До настоящего времени не существует эффективных методов лечения, позволяющих значительно продлить жизнь больному. Поэтому основные надежды ученых возлагаются на перспективы лечения БАС стволовыми клетками.

Лечение Паркинсона стволовыми клетками

При болезни Паркинсона погибают нейроны, отвечающие за продукцию дофамина в головном мозге. Трансплантация их невозможна. Клетки погибают в результате травмирования отростков. Поэтому исследователи считают наилучшим решением введение при болезни Паркинсона стволовых клеток в головной мозг.

В 2014 году японские ученые сумели получить из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток-предшественников нейроны, продуцирующие дофамин. Крысам с болезнью Паркинсона стволовые клетки позволили значительно улучшить состояние. Выживаемость трансплантата была высокой.

В 2015 году исследование провели на обезьянах. Отмечалось достоверное улучшение произвольных движений. Опухоли мозга стволовые клетки не спровоцировали. Период наблюдения составил 2 года.

Лечение болезней легких 

Возможность лечения патологии легких появилась впервые в 2011 году, когда был открыт способ превращения стволовых клеток в клетки, из которых развивается легкое. В настоящее время ученые отыскали способы получения семи видов клеток, которые формируют бронхолегочной аппарат. Основная цель исследований – получение возможности создание биоинженерных легких, пригодных для пересадки. Полученные из собственных тканей пациента, они не будут отторгаться иммунной системой.

Лечение рака легких стволовыми клетками вряд ли будет возможным. Ведь даже пересадка не спасет человека от распространяющихся метастазов. Но при ряде других патологий, таких как легочной фиброз, саркоидоз, муковисцидоз и т.д., она становится единственным эффективным методом, позволяющим сохранить жизнь пациента.

Большой потенциал имеет лечение эмфиземы легких стволовыми клетками, ведь эта патология – одно из наиболее частых показаний к трансплантации. По статистике, эмфизема, как осложнение ХОЗЛ, в структуре показаний к пересадке легких занимает почти 36%. Кроме того, около 7% составляет эмфизема вследствие врожденной антитрипсиновой недостаточности. Итого – 43% людей вынуждены пойти на операцию по трансплантации легких именно по причине эмфиземы.

Также весьма персептивным направлением является лечение астмы стволовыми клетками. Лучший эффект отмечается при их интраназальном (через нос) введении. Результаты проведенных в Австралии клинических исследований были опубликованы в июле 2017 года в журнале The FASEB Journal.

Отмечается, что использование стволовых клеток при астме позволяет добиться таких эффектов:

  • Уменьшение воспаления
  • Нормализация реактивности бронхов
  • Уменьшение патологических структурных изменений, включая фиброз дыхательных путей

Метод может использоваться как основной или дополнительный в случае астмы, плохо поддающейся терапии глюкокортикоидами.

Лечение печени стволовыми клетками

Недавно ученым удалось вырастить печень из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека и мыши. Результаты исследования были опубликованы в августе 2016 года. Это открывает новые перспективы в лечении цирроза печени стволовыми клетками и других заболеваний, требующих трансплантации. Выращенный орган имел естественные структурные элементы, такие как гепатоциты, кровеносные сосуды, желчевыводящие протоки.

В настоящее время при тяжелых поражениях печени проводится трансплантация органа. Но такой подход несет в себе ряд очевидных недостатков. Это и дефицит донорского материала, и риск отторжения пересаженной печени, и необходимость принимать иммунодепрессанты с повышением риска тяжелых инфекционных патологий. Поэтому для пациентов, у которых развился цирроз печени, лечение стволовыми клетками более предпочтительно.

До настоящего времени попытки пересадки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток оставались неуспешными. Они попросту не развивались до зрелых гепатоцитов. Но доктору медицинских наук Трэйси Грикшейту удалось решить эту проблему. Из плюрипотентных стволовых клеток мыши и человека были созданы две модели органоида печени. По задумке исследователей после трансплантации они должны были развиться в полноценный орган.

Обе модели были подсажены мышам. В тканеинженерной печени присутствовали все типы клеток, характерные для этого органа. В крови мыши был обнаружен человеческий альбумин, что свидетельствует о том, что орган выполняет свою функцию после пересадки. Поэтому лечение стволовыми клетками рака печени и других патологий, требующих трансплантации, стало еще на один шаг ближе.

Но клеточная организация отличается от нативной ткани печени. К тому же, после пересадки орган выполняет не все функции. Поэтому пока что в клинической практике стволовые клетки при циррозе печени не применяются, а лечение фиброза печени стволовыми клетками на людях не исследуется. Но в будущем, как уверяют ученые, все препятствия на пути к получению генноинженероной печени будут устранены. Правда, для этого потребуется еще несколько лет исследований и немалое финансовое обеспечение.

Выращивание почки из стволовых клеток

17 ноября 2013 года в журнале Nature Cell Biology были опубликованы результаты исследований Хуана Карлоса Бельмонте (Сан-Диего, США). Ученому и его команде удалось впервые вырастить из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток почку без использования каркаса.

Ранее трехмерная структура почки уже создавалась. Но зачаток почки выращивался с использованием каркаса. Он представлял собой почечный внеклеточный матрикс с кровеносными сосудами. В этот раз исследователям удалось вырастить почку без каркаса. Как оказалось, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки способны дифференцироваться до клеток, которые обнаруживаются в зачатках мочеточника на ранних стадиях развития почек.

В исследовании применялись два вида клеток: это индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, источником которых стала кожа, а также эмбриональные стволовые клетки. Оба вида дифференцировались в мезодерму – зародышевый листок, из которого образуется мочеполовая система. В культуру клеток, чтобы инициировать их правильное созревание, включали факторы роста. Также к культуре были добавлены клетки эмбриональных зачатков мышиных мочеточников. Они стимулировали дальнейшее созревание зачатка почек.

Ученые предполагают, что благодаря этой технологии скоро станет возможным лечение хронической почечной недостаточности стволовыми клетками. Она развивается из-за необратимого повреждения нефронов. Любые заболевания почек провоцируют постепенное уменьшение количества функциональных клеток. Они замещаются соединительной тканью. Когда нефронов остается менее 10%, развиваются симптомы почечной недостаточности.

Восстановить ткани почки консервативными методами невозможно. Применяется лишь пересадка почек от донора. Но такой подход имеет ряд недостатков. Это и необходимость поиска донора, и пожизненная потребность в приеме препаратов, угнетающих иммунные реакции отторжения. Поэтому выращивание почки из стволовых клеток стало настоящим прорывом в медицине. Методика уже проходит клинические исследования. Предпринимаются попытки лечения поликистоза почек стволовыми клетками – тяжелого генетически обусловленного заболевания, провоцирующего почечную недостаточность. С помощью новой методики больные смогут получить аутологичную (генетически родную) почку, выращенную из собственных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Она не будет отторгаться иммунной системой. Поэтому не будет необходимости в приеме иммунодепрессантов.

Диабет и стволовые клетки

Немалый научный интерес вызывает лечение сахарного диабета 1 типа стволовыми клетками. В настоящее время это заболевание считается неизлечимым. В случае повреждения клеток поджелудочной железы, вырабатывающей инсулин, пациент вынужден пожизненно получать инъекции этого гормона.

В октябре 2014 года было проведено исследование, в ходе которого из эмбриональных стволовых клеток ученые Гарвардского Университета вырастили множество функционирующих бета-клеток поджелудочной железы. Они оказались функционирующими. Исследователи признали их пригодными для использования в фармакологической промышленности (получение инсулина для заместительной гормональной терапии) или трансплантологии. Ожидается, что пересадка стволовых клеток при сахарном диабете поможет добиться длительной ремиссии заболевания.

Вскоре были проведены испытания на лабораторных животных. Оказалось, что лечение диабета 1 типа стволовыми клетками у мышей проходит достаточно эффективно. Уже через 2 недели после пересадки начал вырабатываться инсулин в количествах, достаточных для нормализации углеводного обмена. К сожалению, лечение стволовыми клетками сахарного диабета 1 типа у людей не представляется возможным. Заболевание имеет аутоиммунную природу. Собственный иммунитет, первично уничтоживший бета-клетки, сделает это повторно после трансплантации. Поэтому улучшение углеводного обмена не будет долговременным.

В 2015 году было проведено аналогичное исследование на мышах. Но на этот раз источниками для бета-клеток стали индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека. Они воспроизводили инсулин, хотя и в меньших количествах.

Бета-клетки имплантировались под капсулу почки. Там они формировали новый орган, который синтезировал инсулин в течение нескольких месяцев. Уровень глюкозы в крови оставался стабильным. Использование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в лечении диабета 1 типа вместо эмбриональных имеет неоспоримое преимущество, так как позволяет решить этическую проблему данного метода терапии.

Таким образом, радикальное лечение сахарного диабета стволовыми клетками пока что остается невозможным. Полного выздоровления не происходит. Но есть и другие направления лечения сахарного диабета с помощью стволовых клеток. Болезнь вызывает множество опасных осложнений. Одно из самых частых – диабетическая стопа: появление на ногах ран, которые не заживают.

В будущем проблему можно будет решить при помощи индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Первые результаты исследований в данном направлении были опубликованы в 2016 году. Клетки, полученные из ран диабетиков, были перепрограммированы в плюрипотентное состояние. В ходе исследовательской работы ученые установили, что заживлению ран мешает белок фибронектин.

Теперь целью исследователей является поиск методов получения клеток, введение которых позволило бы добиться ускоренного заживления ран. Этот элемент лечения диабета стволовыми клетками очень важен для пациентов. Диабетическая стопа нарушает качество жизни и становится причиной ампутации конечностей.

Лечение гипотиреоза стволовыми клетками

Еще одним частым заболеванием эндокринной системы является гипотиреоз. В 2015 году в Бостонском Университете была разработана технология лечения недостаточности функции щитовидной железы при помощи индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Первые испытания прошли на мышах. У грызунов удалось добиться регенерации функциональной ткани щитовидной железы.

Следующим этапом исследования станет трансплантация клеток щитовидки, полученной путем перепрограммирования собственных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, детям с врожденным гипотиреозом, вызванным нарушением внутриутробного развития щитовидной железы.

Лечение СПИДа стволовыми клетками

Известно, что около 1% жителей планеты невосприимчивы к ВИЧ. Вирус не в состоянии инфицировать клетки из-за изменения свойств поверхностных рецепторов хемокинов CCR5. Это изменение обусловлено мутацией гена CCR5-Δ32.

Ранее уже предпринимались успешные попытки лечения ВИЧ стволовыми клетками. Для этого использовалась трансплантация костного мозга от пациентов, невосприимчивых к этой инфекции. Но таких людей мало. Шансы найти подходящего донора минимальны. Так что данный метод – сугубо экспериментальный. Он не может использоваться массово. Поэтому ученые из Калифорнийского Университета (США) решили вызывать мутацию гена CCR5-Δ32 в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках искусственно. В экспериментах использовались аутологичные (собственные) клетки. После редактирования генома они вводились пациентам.

Следующая цель исследователей – создание клеток с мутацией CCR5-Δ32, из которых смогут образоваться любые клетки белого ростка кроветворения. Кроме того, требуются исследования, направленные на оценку профиля безопасности такого лечения. Ведь вполне вероятно, что трансплантация клеток-предшественников с мутацией CCR5-Δ32 вызовет негативные последствия у некоторых пациентов.

Лечение облысения стволовыми клетками

При облысении стволовые клетки тоже могут быть использованы. В 2014 году ученые Университета Пенсильвании опубликовали исследование, в котором индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, полученные из кожи человека, были дифференцированы до эпителиальных стволовых клеток, содержащихся в волосяных фолликулах.

После имплантации этих клеток мышам были сформированы зачатки стержней волос. Появился функциональный эпидермис. Но в медицинской практике метод пока что неприменим. Ведь команде исследователей пока что не удалось вырастить волосяной сосочек, являющийся важной частью волосяного фолликула.

Где используется клеточная терапия?

Пока что индуцированные плюрипотентные стволовые клетки находят ограниченное применение в медицине. Но есть и другие виды стволовых клеток, например, мезенхимальные, которые давно и успешно применяются в развитых странах мира. Всеми преимуществами клеточной терапии можно воспользоваться, обратившись в Клинику расширенной биологической медицины, которая находится во Франкфурте на Майне, в Германии. Здесь в процессе лечения максимально задействуются регенераторные возможности организма. При помощи стволовых клеток происходит восстановление поврежденных органов и тканей человека.

Организацией лечения за границей уже много лет занимается компания Booking Health. Если вы желаете пройти курс лечения стволовыми клетками, мы поможем выбрать подходящую клинику, а также полностью организуем вашу поездку на лечение.

Вы получите полный пакет сервисных услуг:

  • Помощь в оформлении визы
  • Бронирование гостиницы и авиабилетов
  • Перевод медицинской документации на немецкий язык
  • Предоставление переводчика в Германии
  • Трансфер из аэропорта в клинику и обратно

Обращаясь в Booking Health, вы получаете ряд преимуществ, а именно:

  • Уменьшение времени ожидания приема врача и начала лечения
  • Экономия до 70% (у нас заключен прямой договор с Клиникой расширенной биологической медицины)
  • Страховка, покрывающая все непредвиденные медицинские расходы в течение всего лечения, а также в течение 4 лет после его окончания
  • Консультации врача без дополнительной оплаты в течение 3 месяцев после завершения терапевтической программы

Чтобы воспользоваться преимуществами, которые дает вам компания Booking Health, оформите заявку на сайте. После изучения медицинской документации, наш специалист свяжется с вами для обсуждения деталей.

 

Выбирайте лечение за рубежом и Вы, несомненно, получите отличный результат!

 


Автор: Доктор Вадим Жилюк

 

Читайте:

Почему Booking Health – Вопросы и ответы

Грыжа межпозвоночного диска

Инновационные методы лечения грыжи диска

Направления эндопротезирования суставов в Германии

СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ | Энциклопедия Кругосвет

Содержание статьи

СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ. Характерной особенностью стволовых клеток является их способность к неограниченному делению в культуре с образованием специализированных клеток. Их роль становится понятной при рассмотрении развития организма человека. Это развитие начинается с оплодотворения яйцеклетки и образования зиготы, которая дает начало целому организму. Оплодотворенная яйцеклетка тотипотентна – она обладает неограниченным потенциалом в том смысле, что ее одной достаточно для формирования и развития нормального плода при соответствующих условиях. В первые часы после оплодотворения она делится с образованием идентичных тотипотентных клеток (рис 1.), и любая из них, будучи имплантирована в матку женщины, способна дать начало развитию плода. Примерно через четверо суток после оплодотворения, когда проходит несколько циклов клеточного деления, тотипотентные клетки начинают специализироваться с образованием сферической структуры, называемой бластоцистой. У бластоцисты есть наружный слой и внутренняя полость, где образуется внутренняя клеточная масса. Из наружного слоя развивается плацента и другие поддерживающие структуры, необходимые для формирования плода, а из внутренней клеточной массы – практически все органы и ткани самого плода. Клетки внутренней клеточной массы плюрипотентны – их наличие является необходимым, но не достаточным условием формирования плода. Если их имплантировать в матку женщины, то беременность не наступит.

Рис. 1.

Плюрипотентные клетки подвергаются дальнейшей специализации с образованием стволовых клеток, которые дают начало еще более специализированным клеткам, обладающими специфическими функциями. Так, из кроветворных (гемопоэтических) стволовых клеток развиваются эритроциты, лейкоциты и тромбоциты, а из стволовых клеток кожи – различные типы клеток этой ткани. О стволовых клетках говорят, что они полипотентны (рис. 2). Полипотентные стволовые клетки присутствуют не только у эмбриона, но и в организме новорожденного и взрослого человека. Так, гемопоэтические стволовые клетки, находящиеся в основном в костном мозге, а также в небольшом количестве циркулирующие в крови, ответственны за постоянное образование новых клеток крови взамен разрушенных, и этот процесс продолжается всю жизнь.

Рис. 2.

Получение плюрипотентных клеток.

В настоящее время линии плюрипотентных клеток человека получают из двух источников с помощью методов, отработанных на животных моделях.

а) Плюрипотентные клетки выделяют непосредственно из внутренней клеточной массы эмбриона человека на стадии бластоцисты. Сам эмбриональный материал получали в больших количествах в клинических, а не исследовательских целях для осуществления экстракорпорального оплодотворения, всякий раз испрашивая разрешение на его использование у обоих доноров. Клетки внутренней клеточной массы культивировали и получали линию плюрипотентных клеток (рис. 3).

Рис. 3.

б) Другая группа исследователей выделяла плюрипотентные клетки из ткани плода. Разрешение на это давалось обоими супругами уже после того, как они сами приняли решение прервать беременность. Клетки отбирались из той области плода, которая должна была развиться в яичники или семенники.

Несмотря на то что плюрипотентные клетки в двух указанных случаях происходили из разных источников, полученные клеточные линии были идентичными (рис. 3).

Еще одним способом получения плюрипотентных клеток может стать метод, основанный на переносе в энуклеированную (лишенную ядра) яйцеклетку ядра соматической клетки. Соответствующие опыты уже проведены на животных. Сама яйцеклетка с новым ядром и ее непосредственные «потомки» способны при соответствующих условиях развиться в полноценный организм, т.е. являются титопотентными. Из них формируется бластоциста, которая и служит источником плюрипотентных клеток (рис. 4).

Рис. 4.

Возможное применение плюрипотентных клеток.

Изолированные плюрипотентные клетки человека – очень ценный материал для исследователей и клиницистов (рис. 5). Эксперименты с их использованием могут помочь разобраться в сложнейших процессах развития человеческого организма, и прежде всего в том, что именно влияет на принятие клеткой решения о переходе от стадии роста и деления к стадии дифференцировки. Известно, что ключевым моментом здесь является «включение» и «выключение» специфических генов, но мы мало что знаем и о самих этих генах, и о том, какие события предшествуют их переключению. Разобравшись в функционировании клетки в норме, мы сумеем понять, какие сбои в ее работе приводят к фатальным для организма последствиям.

Рис. 5.

Выделение плюрипотентных клеток человека открывает новые возможности перед исследователями, занимающимися поисками новых лекарственных веществ и их тестированием. Разнообразные клеточные линии (например, линии раковых клеток) используются в этих целях уже сейчас, а культура плюрипотентных клеток позволяет проводить тестирование сразу на нескольких типах клеток. Это не заменяет тестирование на уровне целого организма, но значительно облегчает поиск новых лекарственных веществ.

Одно из самых впечатляющих применений плюрипотентных клеток человека – это так называемая «клеточная терапия». Многие заболевания человека обусловливаются нарушением функционирования клеток или целых органов, и сегодня для устранения дефекта в таких случаях используется метод трансплантации. К сожалению, нередко повреждения носят множественный характер, и заменить все затронутые ими органы не представляется возможным. Плюрипотентные клетки, стимулированные к дифференцировке с образованием строго специализированных клеток, могут служить возобновляемым источником не затронутых поражением клеток, замещающих выбывшие из строя дефектные клетки. Это открывает широкие возможности для лечения самых разных заболеваний человека, включая такие серьезные, как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, сердечно-сосудистые заболевания, ревматоидный артрит, диабет и др. Мы рассмотрим здесь два таких примера.

I. Предварительные эксперименты на мышах показали, что трансплантация нормальных клеток сердечной мышцы животным, страдающим сердечной недостаточностью, приводит к частичной замене пораженных клеток и восстановлению сердечной деятельности. При этом никакого отторжения донорных клеток клетками-хозяевами не наблюдалось. Есть основания полагать, что аналогичной процедуре можно подвергнуть и человека, страдающего сердечной недостаточностью, используя в качестве трансплантата клетки сердечной мышцы, полученные из плюрипотентных клеток человека.

II. У больных, страдающих диабетом I типа, нарушена секреция инсулина специализированными, так называемыми островковыми клетками поджелудочной железы, и такие больные нуждаются в инъекциях инсулина. Есть данные о том, что трансплантация таким больным целой поджелудочной железы или островковых клеток позволяет существенно снизить дозу препарата. Островковые клетки, полученные из плюрипотентных клеток человека, можно использовать как в исследовательских целях для изучения диабета, так и для клеточной терапии.

Несмотря на всю перспективность описанного подхода, пройдет еще немало времени, прежде чем его удастся применить в клинике. Во-первых, необходимо выяснить, какие события предшествуют переходу клетки в организме человека к стадии дифференцировки; только тогда мы сможем направленно изменять ход событий, чтобы получить из плюрипотентных клеток именно те, которые нужны для трансплантации. Во-вторых, прежде чем вводить культивированные клетки в организм человека, следует решить проблему иммунологического отторжения. Поскольку плюрипотентные клетки, взятые из бластоцисты или ткани плода, вряд ли будут идентичны клеткам реципиента, необходимо научиться модифицировать их для минимизации этого различия или создать банк тканей.

В некоторых случаях проблему несовместимости удается решить, используя метод переноса ядра соматической клетки. Предположим, что пациент страдает прогрессирующей сердечной недостаточностью. Если взять у него любую соматическую клетку и ввести ее ядро в энуклеированную яйцеклетку-реципиент, мы получим химерную яйцеклетку, у которой практически весь генетический материал идентичен таковому у пациента. Из нее можно получить бластоцисту, а затем, отобрав клетки внутренней клеточной массы, – плюрипотентные клетки. Последние можно стимулировать к образованию клеток сердечной мышцы, идентичных в генетическом отношении нормальным клеткам пациента, и имплантировать их больному без необходимости подвергать подвергать его иммуносупрессорной терапии, чреватой серьезными последствиями.

Еще более впечатляющее применение стволовых клеток человека – генная терапия ex vivo. В этом случае в организм больного можно инфузировать не обычные стволовые клетки, а генетически модифицированные, которые замещают дефектные клетки или восполняют недостаток продукта того гена, который включен в геном инфузируемых клеток. Стволовые клетки можно получать от самого пациента или от совместимых с ним доноров. Следует отметить, однако, что генная терапия ex vivo с применением стволовых клеток человека делает лишь первые шаги. Гораздо более реальным является использование модифицированных эмбриональных стволовых клеток для создания трансгенных животных. Соответствующие эксперименты уже широко проводятся на мышах. Сначала получают эмбриональные стволовые клетки из внутренней клеточной массы бластоцисты мыши. Их генетически модифицируют (трансформируют) с помощью вектора, несущего нужный ген (трансген), культивируют и отбирают тем или иным способом. Популяцию трансфицированных клеток вновь культивируют и вводят в бластоцисты, которые затем имплантируют в матку «суррогатной» матери. Скрещивая животных, несущих трансген в клетках зародышевой линии мыши, получают линию трансгенных мышей (рис. 6). В геном стволовой клетки можно не только встроить полезный ген, кодирующий какой-либо необходимый организму продукт, но и направленным образом вывести из строя («нокаутировать») ген, кодирующий, например, какой-нибудь токсин. Трансгенных мышей с нарушениями в определенном гене широко используют в качестве модели для изучения заболеваний человека на молекулярном уровне.

Рис. 6.

Стволовые клетки взрослого организма.

Полипотентные стволовые клетки присутствуют в некоторых тканях взрослого организма (например, мы уже говорили о гемопоэтических стволовых клетках). Они служат источником клеток различных тканей, естественным образом выбывающих из строя. Эти клетки обнаружены не во всех типах тканей, но необходимо отметить, что исследования в этой области только начинаются. Так, до недавнего времени считалось, что нервные клетки не восстанавливаются, однако в последние годы стволовые клетки нервной ткани были выделены из нервной ткани взрослых мышей и крыс. Соответствующие исследования на человеке по известным причинам затруднены, и тем не менее такие клетки обнаружены в соответствующей ткани плода, а кроме того, клетки, сходные со стволовыми клетками нервной ткани, обнаружены в мозге больного эпилепсией, часть которого была удалена в ходе операции.

Обладают ли стволовые клетки взрослого организма таким же потенциалом, как и плюрипотентные клетки?

До недавнего времени практически не было данных о том, что полипотентные стволовые клетки млекопитающих, например гемопоэтические стволовые клетки, могут изменить направление своего развития и дать начало клеткам кожи, печени или любым другим специализированным клеткам, отличным от форменных элементов крови. Однако проведенные в последние годы опыты на животных показали, что здесь еще рано ставить точку. Обнаружилось, что некоторые стволовые клетки животных, ранее считавшиеся строго специализированными, при некоторых условиях могут менять свою специализацию. Так, стволовые клетки нервной ткани мыши, введенные в костный мозг, оказались способными дифференцироваться в разные клетки крови, а стволовые клетки, обнаруженные в костном мозге крыс, могут дифференцироваться в клетки печени. Эти впечатляющие эксперименты свидетельствуют о том, что при определенных условиях стволовые клетки проявляют большую гибкость, чем это считалось ранее.

Почему нельзя использовать «взрослые» стволовые клетки в медицинских целях прямо сейчас.

Стимулом к изучению стволовых клеток человека служит то, что они таят в себе огромные возможности как с чисто научной точки зрения, так и в том, что касается их применения в клеточной терапии. Прежде всего речь идет о тех преимуществах, которые дает их использование при трансплантации. Если бы удалось получить стволовую клетку от взрослого индивида, стимулировать ее деление и изменить специализацию, ее можно было бы ввести в организм донора, не опасаясь отторжения. Такой подход мог бы избавить от необходимости использовать стволовые клетки человеческого эмбриона или плода – эта практика вызывает неприятие общественности по этическим соображениям.

Однако, несмотря на всю перспективность, этот метод сталкивается с серьезными проблемами. Во-первых, стволовые клетки обнаружены далеко не во всех типах тканей взрослого человека. Так, не найдены стволовые клетки сердечной мышцы и островков поджелудочной железы. Во-вторых, даже если такие клетки обнаружены, они присутствуют в тканях в очень малых количествах и их трудно выделить и очистить, а с возрастом их становится еще меньше.

Чтобы стволовые клетки взрослого человека можно было использовать для его же лечения, нужно прежде всего получить их от данного пациента, затем культивировать до достижения достаточно большой плотности, чтобы их хватило для терапии. Однако бывают случаи, когда болезнь просто не дает времени на проведение всех этих процедур, а кроме того, если заболевание имеет генетическую природу, пораженными скорее всего будут и стволовые клетки. Есть указания на то, что стволовые клетки взрослого организма делятся не так быстро, как стволовые клетки плода, а их ДНК, по-видимому, содержит больше нарушений.

Не очень перспективным представляется и использование «взрослых» стволовых клеток для изучения ранних этапов клеточной специализации, поскольку эти клетки уже прошли долгий путь в одном направлении. Кроме того, из одной линии «взрослых» стволовых клеток можно получить не более 3–4 типов тканей. Прежде чем мы сможем ответить на вопрос, какие именно стволовые клетки нужно иметь, чтобы справиться с тем или иным новым заболеванием, совершенно необходимо исследовать потенциал «взрослых» стволовых клеток и сравнить его с потенциалом плюрипотентных клеток.

Плюрипотентные стволовые клетки — Викиверситет

Добро пожаловать в учебный проект Викиверситета для плюрипотентных стволовых клеток . Этот проект предоставляет учебные ресурсы, которые помогают участникам узнать о стволовых клетках и усилиях по производству стволовых клеток, полезных для лечения. Участники должны свободно задавать вопросы и изучать связанные темы.

Для многих пациентов донорские органы и трансплантированные ткани используются в качестве замены частей тела, которые повреждены или неправильно функционируют из-за болезни.Плюрипотентные стволовые клетки являются предметом текущих исследований как потенциальный источник замещающих клеток и тканей для лечения. Потенциальное медицинское использование плюрипотентных стволовых клеток в значительной степени является предметом предположений, но было высказано предположение, что исследования стволовых клеток могут в конечном итоге привести к лечению нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона и Альцгеймера, и позволить некоторое восстановление неврологических функций после травм спинного мозга и инсульт. Методы плюрипотентных стволовых клеток могут улучшить лечение тканей, поврежденных ожогами, сердечными заболеваниями, диабетом, остеоартритом и ревматоидным артритом.

Рисунок 1 . Нормальное расположение плюрипотентных стволовых клеток (зеленый) в раннем эмбрионе.

Клетки в организме человека являются фундаментальными функциональными и структурными компонентами. Большинство клеток вашего тела специализируются на определенных функциях, таких как мышечные клетки, которые обеспечивают эффективное сокращение и позволяют вашему телу двигаться.

Во многих тканях есть «взрослые стволовые клетки», которые еще не полностью специализировались. Естественно существующие «взрослые» стволовые клетки предоставляют ограниченную способность вашего тела заменять старые и поврежденные клетки. [1]

Цель медицинских исследований — научиться контролировать и использовать стволовые клетки, чтобы сделать возможным новое и улучшенное медицинское вмешательство для лечения повреждений тканей. Стволовые клетки обычно ограничены с точки зрения их потенциала развития. Предоставленные сами себе, большинство взрослых стволовых клеток дифференцируются в один из нескольких родственных типов клеток. Однако во время эмбрионального развития некоторые стволовые клетки обладают способностью дифференцироваться во все типы клеток: они «плюрипотентны».

Примечание : Есть интерес к идее, что можно было бы изолировать плюрипотентные стволовые клетки от взрослых. Например, см .: Стволовые клетки костного мозга — наш ключ к долголетию?

Обсуждение [править | править источник]

Что происходит с количеством взрослых стволовых клеток в тканях человека, когда мы становимся старше?

Плюрипотентные стволовые клетки обычно очень редки и естественным образом существуют в ранних эмбрионах, как показано на Рисунке 1. С 1981 года стали доступны методы для выделения и выращивания эмбриональных стволовых клеток в лабораториях. [2]

Подобные методы были доступны с конца 1990-х годов для плюрипотентных стволовых клеток человеческого эмбриона, [3] , но лечение стволовыми клетками не может использовать только какие-либо стволовые клетки. Стволовые клетки должны быть получены от каждого пациента, чтобы предотвратить отторжение клеток.

Рисунок 2 . Ядра взрослых клеток можно перепрограммировать путем переноса в ооциты. Полученный в результате эмбрион содержит плюрипотентные стволовые клетки с ядерной ДНК взрослой клетки и митохондриальной ДНК цитоплазмы яйца хозяина.Это метод, используемый для создания клонированных животных, таких как Долли.

Чтобы создать плюрипотентные стволовые клетки для пациентов, которые не будут отвергнуты иммунологически, был широко изучен перенос ядер. Как показано на рисунке 2, ядра можно удалить из дифференцированных клеток пациента и ввести в ооциты. Цитоплазма ооцитов содержит белки, которые могут перепрограммировать ядерную ДНК до состояния эмбриональных стволовых клеток.

Другой подход к перепрограммированию взрослых клеток заключается в использовании белков из культивируемых эмбриональных стволовых клеток [4] .Простое слияние соматических клеток и эмбриональных стволовых клеток приводит к тетраплоидным клеткам, в которых ДНК соматических клеток, по-видимому, перепрограммируется в состояние стволовых клеток.

Было показано, что ДНК специфических генов, важных для состояния эмбриональных стволовых клеток, таких как Oct4, перепрограммируется после слияния соматических клеток и эмбриональных стволовых клеток [5] . Такое перепрограммирование ДНК включает такие модификации, как метилирование.

Обсуждение [править | править источник]

Литература : Ответственный надзор за исследованиями стволовых клеток человека: Медицинские и этические стандарты Калифорнийского института регенеративной медицины Джеффри П.Ломакс, Зак У. Холл и Бернард Ло в PLoS Medicine (2007) 4 (5): e114.

В. Почему некоторые правительства ограничивают финансирование исследований стволовых клеток, а другие нет?

Что заставляет стволовую клетку вести себя как стволовая клетка? [Edit | править источник]

Каждый специализированный тип клеток активно транскрибирует подмножество всех доступных генов. Ключевыми регуляторными белками, которые контролируют, какие гены активны в любом данном типе клеток, являются ДНК-связывающие белки контроля транскрипции.

Существует возможность того, что эмбриональные стволовые клетки обычно создаются путем проверки того, что ооциты содержат правильные белки и мРНК, необходимые для инициации паттерна транскрипции эмбриональных стволовых клеток.Потенциально все белки, необходимые для определения судьбы эмбриональных стволовых клеток, могут быть ДНК-связывающими факторами транскрипции и связанными с ними регуляторными белками. Было обнаружено, что несколько факторов транскрипции особенно важны для создания и поддержания эмбриональных стволовых клеток.

Oct4 [править | править источник]
Рисунок 3 . Oct4 — это белок контроля транскрипции с двумя ДНК-связывающими доменами. На этой диаграмме молекулярной структуры белок Oct коричневого цвета, а цепи ДНК синего и фиолетового цвета.

Одним из ключевых белков, участвующих в перепрограммировании ядер взрослых клеток до состояния стволовых клеток, является фактор транскрипции Oct4. Работая с мышами как с удобными лабораторными млекопитающими, в 1990 году было обнаружено, что Oct4 хранится внутри ооцитов и экспрессируется на высоком уровне в эмбриональных стволовых клетках [6] . Сообщалось, что дочерние клетки эмбриональных стволовых клеток, которые начинают специализироваться и дифференцироваться во время эмбиогенеза мышей, снижают уровень белка Oct4 [7] .

Функциональная роль Oct4 внутри эмбриональных стволовых клеток интенсивно изучалась на мышах.На рисунке 5 представлена ​​сводка многих известных действий Oct4 в стволовых клетках мыши. [8] В этой серии экспериментов было идентифицировано 1155 генных транскриптов, экспрессирующихся по паттерну, аналогичному таковому у Oct4; все эти транскрипты, кроме 69, положительно коррелировали с Oct4. Экспрессия Nanog и Sox2 (подробнее об этих факторах транскрипции эмбриональных стволовых клеток см. Ниже) коррелировала с экспрессией Oct4 на 97% и 49% в этих экспериментах на мышах.

Рисунок 4 .Модель молекулярной структуры, демонстрирующая совместное связывание Sox2 и белка семейства Oct с ДНК [9] .
Sox2 [править | править источник]

Oct4 и Sox2, как полагают, взаимодействуют при связывании с регуляторными последовательностями некоторых важных для развития генов [10] . Было показано, что 392 из генов с экспрессией, коррелированной с Oct4, которые были идентифицированы Rudnicki et al. [8] , имеют возможные регуляторные последовательности генов для скоординированного связывания Oct4 и Sox2. На рис. 4 показаны белки факторов транскрипции Oct и Sox, связанные с ДНК.

Nanog [править | править источник]

Рост эмбриональных стволовых клеток мыши в культуре клеток обычно зависит от фактора роста, называемого фактором ингибирования лейкемии (LIF). В 2003 году две исследовательские группы сообщили, что Nanog является фактором транскрипции, который позволяет эмбриональным стволовым клеткам мыши расти в культуре независимо от LIF [11] [12] . Ген Nanog положительно регулируется Oct4 и Sox2 [13] . Считается, что белок Nanog может сотрудничать с Oct4 и Sox2 в поддержании состояния эмбриональных стволовых клеток.

Стволовые клетки человека [править | править источник]

Как обсуждалось выше, большинство исследований эмбриональных стволовых клеток проводилось на мышах. Было обнаружено много общего в поведении эмбриональных стволовых клеток человека, но есть некоторые отличия от поведения мышей.

Эмбриональные стволовые клетки человека не нуждаются в LIF для роста в культуре, но они экспрессируют Nanog [14] . Искусственное снижение уровня белка Nanog в эмбриональных стволовых клетках человека посредством нокдауна РНКи приводит к дифференцировке клеток [14] [15] .

Гораздо меньше известно о белках эмбриональных стволовых клеток, таких как Oct4, и о том, как они функционируют у людей, чем у мышей, но Oct4 человека также экспрессируется в эмбриональных стволовых клетках человека [16] . У человека Oct4 экспрессируется в нескольких типах взрослых клеток, поэтому клетки с Oct4 не являются стволовыми, а не стволовые клетки не могут продуцировать Oct4. На то, что Oct4 функционирует для поддержания человеческих эмбриональных стволовых клеток в недифференцированном состоянии, указывают эксперименты, в которых РНК-интерференция использовалась для ингибирования экспрессии Oct4, приводящей к дифференцировке человеческих эмбриональных стволовых клеток [17] [18] .

Перенос генов и индукция стволовых клеток [править | править источник]

Результаты, обсужденные выше, подтверждают возможность того, что возможно перепрограммировать взрослые клетки, чтобы они приняли фенотип эмбриональных стволовых клеток, заставляя их экспрессировать несколько ключевых регуляторных белков, таких как Oct4 и Sox2.

Oct4, Sox2, Nanog и еще один белок, LIN28 (еще один фактор транскрипции, связанный с эмбриональными стволовыми клетками [19] ), были использованы для трансформации соматических клеток в эмбриональные стволовые клетки человека [20] .Ретровирусные векторы использовали для вставки генов Oct4, Sox2, Nanog и LIN28 в клетки-мишени [21] . Oct4 и Sox2 были ключевыми генами. Nanog и, в меньшей степени, LIN28, усиливали восстановление клонов, подобных эмбриональным стволовым клеткам. Клоны, подобные эмбриональным стволовым клеткам, были названы iPS-клетками (индуцированные плюрипотентные стволовые клетки), и необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, могут ли взрослые соматические клетки быть преобразованы в iPS-клетки с использованием Oct4 и Sox2, и можно ли эффективно индуцировать дифференцировку таких клеток. в клетки желаемого типа для медицинского использования.

Аналогичные результаты были получены для Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc [22] . Основная проблема с использованием протонкогена c-Myc заключается в том, что он может вызывать опухоли. Обе исследовательские группы [20] , [22] использовали ретровирусы для вставки генов Oct4 и Sox2 в соматические клетки. Другие возможные методы могут быть более безопасными для медицинских целей.

Рисунок 5 . Предлагаемые функциональные роли фактора стволовых клеток Oct4. [8]

.

Контроль за судьбой эмбриональных стволовых клеток [править | править источник]

Sox2 является одним из членов семейства факторов транскрипции Sox ​​ [23] .Интересна идея, что многие изменения клеточных судеб во время эмбрионального развития включают переключатели, с помощью которых факторы транскрипции семейства Sox экспрессируются в дифференцирующихся клетках. Напр., Sox17 [24] , как полагают, действует в развивающейся энтодерме, чтобы производить контрольный сигнал для сердечного миогенеза в соседней примитивной мезодерме. Это говорит о том, что могут быть [[w: фактор роста | факторы роста], которые могут быть добавлены к культивируемым эмбриональным стволовым клеткам, что приведет к их дифференцировке в определенные типы клеток, такие как кардиомиоциты.

На основании результатов, полученных с использованием эмбриональных стволовых клеток мыши, было высказано предположение, что смесь факторов роста (TGF-ß1, BMP-2 и BMP-4, активин-A, VEGF-A, IL-6, FGF- 2 и -4, IGF-1 и -2 и EGF эффективно превращают стволовые клетки в сердечные клетки-предшественники, которые могут быть имплантированы в сердечную ткань [25] . Аналогичные результаты были получены для эмбриональных стволовых клеток человека, обработанных активином. A и BMP-4 [26] и полученные в результате клетки слизистой оболочки сердца, как было показано, оказывают благоприятное воздействие при переносе в поврежденные сердца крыс.

  1. ↑ Стволовые клетки скелетных мышц Дженнифер С. Дж. Чен и Дэвид Дж. Голдхамер в Reprod Biol Endocrinol (2003) 1: 101.
  2. ↑ Создание в культуре плюрипотенциальных клеток из эмбрионов мыши М. Дж. Эвансом и М. Х. Кауфманом в Nature (1981) Том 292, страницы 154-156.
  3. ↑ Линии эмбриональных стволовых клеток, полученные из бластоцист человека Джеймсом А. Томсоном, Джозефом Ицковиц-Элдором, Сандером С. Шапиро, Мишель А. Вакниц, Дженнифер Дж.Свиергил, Вивьен С. Маршалл и Джеффри М. Джонс в журнале Science (1998), том 282, страницы 1145-1147.
  4. ↑ Ядерное репрограммирование соматических клеток после слияния с человеческими эмбриональными стволовыми клетками C.A. Коуэн, Дж. Атьенца, Д.А. Мелтон и К. Эгган в журнале Science (2005), том 309, страницы 1369-1373.
  5. ↑ Эпигенетическое перепрограммирование регуляторных областей OCT4 и NANOG экстрактом клеток эмбриональной карциномы Кристель Т. Фреберг, Джон Арне Даль, Санна Тимоскайнен и Филипп Коллас в «Молекулярной биологии клетки » (2007) том 18 страниц 1543–1553.
  6. ↑ Новый тип домена POU в протеине Oct-4, специфичном для зародышевой линии, Х. Р. Шёлер, С. Рупперт, Н. Сузуки, К. Чоудхури и П. Грусс в Nature (1990) том 344, стр. 435-439.
  7. ↑ Фактор транскрипции POU-домена в ранних стволовых клетках и половых клетках эмбриона млекопитающих по M.H. Рознер, М.А.Вигано, К. Озато, П.М. Тиммонс, Ф. Пуарье, П.В. Ригби и Л.М.Штаудт в книге Nature (1990), том 345, страницы 686-692.
  8. 8,0 8.1 8,2 Oct4 нацелены на регуляторные узлы для модуляции функции стволовых клеток Перл А. Кэмпбелл, Каролина Перес-Иратксета, Мигель А. Андраде-Наварро и Майкл А. Рудницки в PLoS ONE (2007) 2 (6): e553 ,
  9. ↑ Молекулярная основа синергической транскрипционной активации Oct1 и Sox2, выявленная из структуры раствора 42-кДа Oct1 · Sox2 · Hoxb1-ДНК комплекс тройных факторов транскрипции, Дэвид К. Уильямс младший, Менгли Кай и Г. Мариус Клор в Журнал биологической химии (2003), Vol.279, выпуск 2, 1449–1457
  10. ↑ Кристаллическая структура тройного комплекса POU / HMG / ДНК предполагает дифференциальную сборку Oct4 и Sox2 на двух энхансерах Аттила Ременьи, Катарина Линс, Л. Йохан Ниссен, Роллан Рейнбольд, Ханс Р. Шелер и Маттиас Вильманнс в книге Genes and Development (2003) Том 17 страниц 2048-2059
  11. ↑ Гомеопротеин Nanog необходим для поддержания плюрипотентности в эпибластах мыши и ES-клетках К. Мицуи, Ю. Токудзава, Х. Ито, К. Сегава, М.Мураками, К. Такахаши, М. Маруяма, М. Маэда и С. Яманака в Cell (2003), том 113, страницы 631-642.
  12. ↑ Клонирование функциональной экспрессии Nanog, фактора, поддерживающего плюрипотентность в эмбриональных стволовых клетках. Авторы I. Chambers, D. Colby, M. Robertson, J. Nichols, S. Lee, S. Tweedie и A. Smith в Cell (2003 г.) ) Том 113 страниц 643-655.
  13. ↑ Регуляция транскрипции Nanog посредством OCT4 и SOX2, Дэвид Дж. Родда, Джун-Лин Чу, Ленг-Хионг Лим, Юин-Хан Ло, Бей Ван, Хак-Хуэй Нг и Пол Робсон в журнале Journal of Biological Chemistry (2005) ) Объем 280 страниц 24731-24737.
  14. 14,0 14,1 Подавление NANOG вызывает дифференциацию эмбриональных стволовых клеток человека до внезародышевых линий Луизы Хислопа, Миодраг Стойковица, Лайл Армстронга, Терезия Вальтера, Петра Стойковица, Стефан Пчазиборскич, Альберта Мурберта и др. Lako in Stem Cells (2005) Volume 23, страницы 1035-1043.
  15. ↑ Дифференциация эмбриональных стволовых клеток мыши после опосредованного РНК замалчивания OCT4 и Nanog, автор Shelley R.Hougha, Ian Clementsb, Peter J. Welcha и Kristin A. Wiederholt в Stem Cells (2006) Volume 24, pages 1467-1475.
  16. ↑ Экспрессия мРНК Oct-4 и белка во время доимплантационного развития человека в Молекулярное воспроизводство человека (2005) Том 11, страницы 173-181.
  17. ↑ Специфический нокдаун экспрессии Oct4 и ß2-микроглобулина посредством интерференции РНК в человеческих эмбриональных стволовых клетках и клетках эмбриональной карциномы Марьям М. Матина, Джеймс Р. Уолша, Пол Дж. Гокхалеа, Джонатан С.Драпера, Ахмад Р. Бахрамия, Ян Мортона, Гарри Д. Муреа и Питер У. Эндрюс в стволовых клетках (2004) 22: 659-668.
  18. ↑ Нокдаун 4 октября индуцирует аналогичные паттерны маркеров дифференцировки энтодермы и трофобласта в эмбриональных стволовых клетках человека и мыши Дэвид К. Хэй, Линда Сазерленд, Джон Кларк и Том Бердон в стволовых клетках (2004) 22: 225-235.
  19. ↑ Оценка самообновления и дифференциации в линиях чЭСК Цзинли Цай, Цзя Чен, Ин Лю, Такуми Миура, Юнцюань Луо, Жанна Ф.Лоринг, Уильям Дж. Фрид, Махендра С. Рао и Сяньминь Цзэн в работе Stem Cells (2006) 24 (3): 516–530.
  20. 20,0 20,1 Линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученные из соматических клеток человека Джуниинг Ю, Максим А. Водяник, Ким Смуга-Отто, Джессика Антосевич-Бурже, Дженнифер Л Френ, Шулан Тиан, Джефф Ни, Гудрун А. Джонсдоттир, Виктор Руотти, Рон Стюарт, Игорь Слуквин, Джеймс А. Томсон в Science (2007) 20 ноября; опубликовано в Интернете.
  21. ↑ Лентивирусные векторы для усиленной экспрессии генов в гемопоэтических клетках человека Али Рамезани, Тереза ​​С.Хоули и Роберт Г. Хоули в книге Molecular Therapy (2000) 2 (5): 458-469.
  22. 22,0 22,1 Индукция плюрипотентных стволовых клеток из фибробластов взрослого человека определенными факторами К. Такахаши, К. Танабе, М. Охнуки, М. Нарита, Т. Ичисака, К. Томода и С. Яманака в г. Ячейка (2007), 30 ноября; 131 (5): 861-72.
  23. ↑ Контроль судьбы и дифференцировки клеток с помощью факторов транскрипции боксов с высокой подвижностью (Sox), связанных с Sry, Вероник Лефевр, Богдан Думитриу, Альфредо Пензо-Мендес, Ю Хан и Бхаттарам Паллави в Int J Biochem Cell Biology (2007 ) 39 (12): 2195–2214.
  24. ↑ Sox17 необходим для спецификации сердечной мезодермы в эмбриональных стволовых клетках Ю Лю, Масанори Асакура, Хиронори Иноуэ, Теруя Накамура, Мотоаки Сано, Жийв Ниу, Мишель Чен, Роберт Дж. Шварц и Майкл Д. Шнайдер в Proc Natl. Acad Sci USA (2007) Том 104 страницы 3859–3864.
  25. ↑ Кардиопоэтическое программирование эмбриональных стволовых клеток для восстановления сердца без опухолей Атта Бехфар, Кармен Перес-Терзик, Рэндольф С. Фаустино, Д. Кент Аррелл, Денис М.Ходжсон, Сацуки Ямада, Мишель Пусе, Николас Нидерлендер, Алексей Е Алексеев, Леонид В. Зингман и Андре Терзич в журнале The Journal of Experimental Medicine (2007) Volume 204, страницы 405-420.
  26. ↑ Кардиомиоциты, полученные из человеческих эмбриональных стволовых клеток в факторах, способствующих выживанию, усиливают функцию инфаркта крысиного сердца, М.А.Лафламм, К.Ю. Чен, А. Наумова, В. Мусхели, Я.А. Фугейт, С. Дюпрас, Х. Рейнеке, К. Сюй, М. Хассанипур, С. Полис, К. О’Салливан, Л. Коллинз, Ю. Чен, Э.Минами, Э.А. Гилл, С. Уэно, К. Юань, Дж. Голд и К.Э. Мерри в книге Nature Biotechnology (2007), том 25, страницы 1015-1024.
,

Обещание индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК)

Чарльз А. Голдтуэйт младший, доктор философии.

В 2006 году исследователи из Киотского университета в Японии определили условия, которые позволили бы специализированным взрослым клеткам генетически «перепрограммироваться» и принять состояние, подобное стволовым клеткам. Эти взрослые клетки, называемые индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (ИПСК), были перепрограммированы до состояния, аналогичного эмбриональным стволовым клеткам, путем введения генов, важных для поддержания основных свойств эмбриональных стволовых клеток (ЭСК).С момента этого первоначального открытия исследователи быстро усовершенствовали методы создания ИПСК, создав новый мощный способ «дедифференцировки» клеток, судьба развития которых, как предполагалось ранее, была определена.

Хотя необходимы дополнительные исследования, исследователи начинают сосредотачиваться на потенциальной полезности ИПСК в качестве инструмента для разработки лекарств, моделирования заболеваний и трансплантационной медицины. Идея о том, что ткани пациента могут обеспечить ему / ей обильное количество плюрипотентных клеток, соответствующих иммунитету, захватила воображение исследователей и клиницистов во всем мире.Кроме того, этические вопросы, связанные с производством ESC, не относятся к iPSC, которые предлагают бесспорную стратегию создания линий стволовых клеток для конкретного пациента. В качестве введения в эту захватывающую новую область исследования стволовых клеток в этой главе будут рассмотрены характеристики ИПСК, технические проблемы, которые необходимо преодолеть, прежде чем можно будет применить эту стратегию, а также потенциальные применения клеток в регенеративной медицине.

«Перепрограммирование» клеток: достижение плюрипотентности

Как отмечалось в других главах, стволовые клетки представляют собой драгоценный товар.Несмотря на то, что они присутствуют в эмбриональных и взрослых тканях, практические соображения, такие как получение эмбриональных тканей и выделение относительно редких типов клеток, ограничивают крупномасштабное производство популяций чистых стволовых клеток (подробности см. В главе «Альтернативные методы получения плюрипотентных стволовых клеток». ). Таким образом, логистические проблемы выделения, культивирования, очистки и дифференциации линий стволовых клеток, извлеченных из тканей, побудили исследователей изучить варианты «создания» плюрипотентных клеток с использованием существующих неплурипотентных клеток.Усовершенствование обильных, легко доступных дифференцированных клеток к плюрипотентности в принципе устранит поиск редких клеток, одновременно предоставив возможность культивировать клинически полезные количества стволовых клеток.

Одной из стратегий для достижения этой цели является перепрограммирование ядра, метод, который включает экспериментальное индуцирование стабильного изменения в ядре зрелой клетки, которое затем может поддерживаться и воспроизводиться по мере деления клетки посредством митоза. Эти изменения наиболее часто связаны с повторным приобретением плюрипотентного состояния, что наделяет клетку потенциалом развития.Стратегия исторически реализовывалась с использованием таких методов, как перенос ядер соматических клеток (SCNT), 1,2 измененного ядерного переноса (ANT), 3,4 и методы слияния соматических клеток с ESC 5,6 ( см. «Альтернативные методы приготовления плюрипотентных стволовых клеток» для получения подробной информации об этих подходах). С клинической точки зрения эти методы имеют несколько недостатков, таких как создание эмбриона или развитие гибридных клеток, которые не подходят для лечения болезни.Однако в 2006 году эти усилия послужили основой для разработки ядерного репрограммирования in vitro, революционного метода создания ИПСК.

Этот подход включает взятие зрелых «соматических» клеток у взрослого человека и введение генов, кодирующих критические белки факторов транскрипции, которые сами регулируют функцию других генов, важных для ранних стадий эмбрионального развития (см. Рис. 10.1). В первоначальном исследовании 2006 года сообщалось, что только четыре фактора транскрипции (Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc) были необходимы для репрограммирования мышиных фибробластов (клеток, обнаруженных в коже и другой соединительной ткани) в эмбриональные стволовые клетки, подобные эмбриональным стволовым клеткам. состояние, заставляя их экспрессировать гены, важные для поддержания определяющих свойств ESCs. 7 Эти факторы были выбраны, поскольку известно, что они участвуют в поддержании плюрипотентности, то есть способности генерировать все другие типы клеток тела. Было обнаружено, что вновь созданные ИПСК очень похожи на ЭСК и могут быть созданы после нескольких недель культивирования. 7,8 В 2007 году две различные исследовательские группы достигли нового рубежа, выведя ИПСК из клеток человека, используя либо четыре исходных гена 9 , либо другую комбинацию, содержащую Oct4, Sox2, Nanog и Lin28. 10 С тех пор исследователи сообщили о создании ИПСК из соматических тканей обезьяны 11 и крысы. 12,13

Однако эти оригинальные методы репрограммирования неэффективны, давая ИПСК менее чем в 1% стартовых взрослых клеток. 14,15 Тип используемой взрослой клетки также влияет на эффективность; фибробластам требуется больше времени для экспрессии факторов, и они имеют более низкую эффективность перепрограммирования, чем кератиноциты человека, клетки печени и желудка мыши или нейральные стволовые клетки мыши. 14–19

Несколько подходов были исследованы для повышения эффективности перепрограммирования и уменьшения потенциально вредных побочных эффектов процесса репрограммирования. Поскольку ретровирусы, используемые для доставки четырех факторов транскрипции в самых ранних исследованиях, потенциально могут вызывать мутагенез (см. Ниже), исследователи исследовали, являются ли все четыре фактора абсолютно необходимыми. В частности, известно, что ген c-Myc в некоторых случаях способствует росту опухоли, что отрицательно влияет на полезность ИПСК при трансплантационной терапии.С этой целью исследователи протестировали трехфакторный подход, в котором используется орфанный ядерный рецептор Esrrb с Oct4 и Sox2, и смогли преобразовать эмбриональные фибробласты мыши в ИПСК. 20 Это достижение подтверждает другие сообщения о том, что c-Myc незаменим для прямого репрограммирования фибробластов мыши. 21 Последующие исследования еще больше снизили количество генов, необходимых для репрограммирования, 22–26 , и исследователи продолжают идентифицировать химические вещества, которые могут либо замещать, либо повышать эффективность факторов транскрипции в этом процессе. 27 Эти достижения продолжают информировать и упрощать процесс перепрограммирования, тем самым продвигая область создания стволовых клеток, специфичных для пациента, для клинического применения. Однако, как будет обсуждаться в следующем разделе, метод, с помощью которого факторы транскрипции доставляются в соматические клетки, имеет решающее значение для их потенциального использования в клинике.

Figure 10.1 illustrates a general method for creating induced pluripotent stem cells (iPSCs). At the left, a circular DNA plasmid is used to carry 4 reprogramming factors into the nucleus (shown as a green spherical structure with purple outgrowths on its surface) of a somatic cell (shown in green). The somatic cell is then reprogrammed, and the next step shows that it has changed from an elongated fibroblast-like shape to instead be a rounded, immature type of cell. The final step shows that if cultured as per human embryonic stem cells (hESCs), then a pluripotent iPSC line is produced.

Рисунок 10.1. Создание индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК).

© 2008 Тереза ​​Уинслоу

Текущие проблемы в исследовании iPSC

Перепрограммирование ставит несколько проблем перед исследователями, которые надеются применить его в регенеративной медицине.Для доставки желаемых факторов транскрипции необходимо ввести ДНК, кодирующую их продукцию, и интегрировать в геном соматических клеток. Ранние попытки создания ИПСК достигли этой цели с использованием ретровирусных векторов. Ретровирус — это РНК-вирус, который использует фермент, обратную транскриптазу, для репликации в клетке-хозяине и последующего производства ДНК из его РНК-генома. Эта ДНК встраивается в геном хозяина, позволяя вирусу реплицироваться как часть ДНК клетки-хозяина. Однако принудительную экспрессию этих генов невозможно полностью контролировать, что приводит к непредсказуемым эффектам. 28 В то время как другие типы интегрирующихся вирусов, такие как лентивирусы, могут повысить эффективность репрограммирования, 16 экспрессия вирусных трансгенов остается критической клинической проблемой. Учитывая двойную потребность уменьшения недостатков вирусной интеграции и максимизации эффективности репрограммирования, исследователи изучают ряд стратегий репрограммирования клеток в отсутствие интеграции вирусных векторов 27-30 или использования потенциально более эффективных интегративных подходов. 31,32

Прежде чем перепрограммирование можно будет рассматривать для использования в качестве клинического инструмента, эффективность процесса должна существенно повыситься. Хотя исследователи начали идентифицировать мириады молекулярных путей, которые участвуют в перепрограммировании соматических клеток, 15 потребуются гораздо более фундаментальные исследования, чтобы идентифицировать полный спектр событий, которые активируют этот процесс. Простое добавление факторов транскрипции к популяции дифференцированных клеток не гарантирует перепрограммирования — низкая эффективность перепрограммирования in vitro предполагает, что для генерации ИПСК необходимы дополнительные редкие события, а эффективность перепрограммирования еще больше снижается с фибробластами, которые культивировались в течение длительного времени. периоды. 33 Кроме того, стадия дифференцировки исходной клетки, по-видимому, напрямую влияет на эффективность перепрограммирования; гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники мыши продуцируют ИПСК до 300 раз эффективнее, чем их аналоги с терминально дифференцированными В- и Т-клетками. 34 По мере того, как эта область продолжает развиваться, исследователи изучают репрограммирование стволовых или взрослых клеток-предшественников мышей 24 , 25 , 34 , 35 и людей 23 , 26 в качестве единой стратегии. для увеличения эффективности по сравнению со зрелыми клетками.

Как показывают эти обсуждения, клиническое применение ИПСК потребует безопасного и высокоэффективного получения стволовых клеток. По мере того, как ученые расширяют свое понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе перепрограммирования, они смогут определять типы клеток и условия, которые наиболее эффективно запускают этот процесс, и использовать эту информацию для разработки инструментов для широкого использования. Клиническое применение этих клеток потребует методов перепрограммирования клеток при минимизации изменений ДНК.С этой целью исследователи нашли способы ввести комбинации факторов из одной вирусной «кассеты» в известную генетическую локализацию. 36 Развивающиеся инструменты, подобные этим, позволят исследователям более безопасно стимулировать программирование, тем самым информируя базовые исследования ИПСК и приближая эту технологию к клиническому применению.

Действительно ли iPSC эквивалентны ESC?

ESC и iPSC создаются с использованием разных стратегий и условий, что заставляет исследователей задаться вопросом, действительно ли типы клеток эквивалентны.Чтобы оценить эту проблему, исследователи начали обширные сравнения для определения плюрипотентности, экспрессии генов и функции производных дифференцированных клеток. В конечном счете, эти два типа клеток демонстрируют некоторые различия, но они очень похожи во многих ключевых аспектах, которые могут повлиять на их применение в регенеративной медицине. Будущие эксперименты определят клиническую значимость (если таковая имеется) наблюдаемых различий между типами клеток.

Помимо их происхождения из тканей взрослого человека, ИПСК соответствуют определяющим критериям для ЭСК.ИПСК мыши и человека демонстрируют важные характеристики плюрипотентных стволовых клеток, включая экспрессию маркеров стволовых клеток, формирование опухолей, содержащих типы клеток из всех трех примитивных эмбриональных слоев, и способность вносить вклад во многие различные ткани при введении эмбрионам мыши на очень ранней стадии. развития. Первоначально было неясно, действительно ли iPSCs действительно плюрипотентны, поскольку ранние линии iPSC вносили вклад в эмбриональное развитие мышей, но не могли производить живорожденное потомство, как это делают ESCs.Однако в конце 2009 года несколько исследовательских групп сообщили о линиях ИПСК мышей, способных давать живорожденных, 37,38 , отмечая, что клетки поддерживают плюрипотентный потенциал, который «очень близок» к таковому у ЭСК. 38 Таким образом, ИПСК, по-видимому, действительно плюрипотентны, хотя они менее эффективны, чем ЭСК, в отношении дифференцировки во все типы клеток.38 Кроме того, эти два типа клеток, по-видимому, имеют схожие защитные механизмы, препятствующие образованию повреждающих ДНК активные формы кислорода, тем самым наделяя клетки сравнимыми способностями поддерживать целостность генома. 39

Недифференцированные ИПСК кажутся молекулярно неотличимыми от ЭСК. Однако сравнительный геномный анализ показывает различия между двумя типами клеток. Например, сотни генов по-разному экспрессируются в ESCs и iPSCs, 40 , и, по-видимому, существуют тонкие, но обнаруживаемые различия в эпигенетическом метилировании между двумя типами клеток. 41,42 Следует ожидать геномных различий; сообщалось, что профили экспрессии генов ИПСК и ЭСК одного вида отличаются не более, чем наблюдаемая изменчивость между отдельными линиями ЭСК. 43 Следует отметить, что функциональное значение этих результатов в настоящее время неизвестно, и наблюдаемые различия могут в конечном итоге оказаться функционально несущественными. 44

Недавно некоторые исследователи, которые впервые создали ИПСК человека, сравнили способность ИПСК и ЭСК человека дифференцироваться в нервные клетки (например, нейроны и глии). 45 Их результаты показали, что оба типа клеток следуют одним и тем же этапам и во время дифференцировки.Однако, хотя человеческие ESCs дифференцируются в нервные клетки с одинаковой эффективностью независимо от используемой клеточной линии, нейронные клетки, полученные из iPSC, демонстрируют более низкую эффективность и большую вариабельность при дифференцировке в нервные клетки. Эти наблюдения происходили независимо от того, какой из нескольких протоколов генерации ИПСК использовался для перепрограммирования исходной клетки в плюрипотентное состояние. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что отдельные линии ИПСК могут быть «эпигенетически уникальными» и предрасположены к образованию клеток определенной линии.Однако авторы полагают, что усовершенствования методов культивирования могут помочь преодолеть вариабельность и неэффективность, описанные в этом отчете.

Эти данные подтверждают важность понимания внутренней изменчивости среди дискретных популяций клеток, независимо от того, являются ли они ИПСК или ЭСК. Характеристика изменчивости среди линий ИПСК будет иметь решающее значение для клинического применения клеток. Действительно, факторы, которые делают каждую линию ИПСК уникальной, могут также задерживать широкое использование клеток, поскольку различия между клеточными линиями будут влиять на сравнения и потенциально влиять на их клиническое поведение.Например, для успешного моделирования болезни требуется способность идентифицировать клеточные различия между пациентами и контрольной группой, которые приводят к дисфункции. Эти различия следует рассматривать в контексте биологической изменчивости, присущей данной популяции пациентов. Если линии ИПСК должны использоваться для моделирования болезни или скрининга лекарственных препаратов-кандидатов, то вариабельность между линиями должна быть сведена к минимуму и полностью охарактеризована, чтобы исследователи могли понять, насколько их наблюдаемые результаты соответствуют биологии изучаемого заболевания.Таким образом, стандартизованные анализы и методы будут приобретать все большее значение для клинического применения ИПСК, и необходимо разработать меры контроля, учитывающие вариабельность ИПСК и их производных.

Кроме того, исследователи должны понимать факторы, которые запускают репрограммирование в сторону плюрипотентности в разных типах клеток. Недавний отчет выявил один фактор, который инициирует перепрограммирование в человеческих фибробластах, 46 , заложив основу для разработки прогностических моделей для идентификации тех клеток, которые станут ИПСК.ИПСК может нести генетическую «память» того типа клеток, которым он когда-то был, и эта «память», вероятно, будет влиять на его способность к перепрограммированию. Понимание того, как эта память различается среди разных типов клеток и тканей, необходимо для успешного репрограммирования.

Возможные медицинские применения ИПСК

ИПСК могут стать многоцелевыми исследовательскими и клиническими инструментами для понимания и моделирования заболеваний, разработки и отбора лекарственных препаратов-кандидатов и проведения клеточно-замещающей терапии для поддержки регенеративной медицины.В этом разделе будут изучены возможности и проблемы, которые сопутствуют этим медицинским приложениям, с оговоркой, что некоторые виды использования являются более непосредственными, чем другие. Например, в настоящее время исследователи используют стволовые клетки для тестирования / скрининга лекарств или в качестве материала для исследования для выявления молекул или генов, участвующих в регенерации. Проведение экспериментов или тестирование лекарственных препаратов-кандидатов на клетках человека, выращенных в культуре, позволяет исследователям понять фундаментальные принципы и взаимосвязи, которые в конечном итоге будут определять использование стволовых клеток в качестве источника ткани для трансплантации.Следовательно, использование ИПСК в терапии замещения клеток — это будущее применение этих клеток, хотя и имеющее огромный клинический потенциал. В нижеследующем обсуждении будут освещены недавние усилия по достижению этой цели, при этом признаются проблемы, которые необходимо преодолеть, чтобы эти клетки достигли клиники.

Технология перепрограммирования предлагает потенциал для лечения многих заболеваний, включая болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, сердечно-сосудистые заболевания, диабет и боковой амиотрофический склероз (БАС; также известный как болезнь Лу Герига).Теоретически легкодоступные типы клеток (такие как фибробласты кожи) могут быть взяты у пациента и перепрограммированы, эффективно воспроизводя болезнь пациента в чашке для культивирования. Такие клетки могут затем служить основой для заместительной терапии аутологичных клеток. Поскольку исходные клетки возникают внутри пациента, иммунное отторжение дифференцированных производных будет минимальным. В результате потребность в иммунодепрессивных препаратах для сопровождения трансплантации клеток будет уменьшена и, возможно, полностью устранена.Кроме того, перепрограммированные клетки могут быть направлены на производство типов клеток, которые подвергаются риску или разрушаются рассматриваемым заболеванием. Недавний эксперимент продемонстрировал доказательство принципа в этом отношении, 47 , поскольку ИПСК, полученные от пациента с БАС, были направлены на дифференцировку в двигательные нейроны, которые являются клетками, которые разрушаются при заболевании.

Хотя перед применением ИПСК в клинике потребуются дополнительные фундаментальные исследования, эти клетки представляют собой многоцелевые инструменты для медицинских исследований.Используя методы, описанные в этой статье, исследователи теперь создают множество ИПСК для конкретных заболеваний. Например, дермальные фибробласты и мезенцихмальные клетки костного мозга были использованы для определения ИПСК у пациентов с различными заболеваниями, включая БАС, тяжелый комбинированный иммунодефицит, связанный с дефицитом аденозиндезаминазы, синдром Швахмана-Бодиана-Даймонда, болезнь Гоше типа III, Мышечные дистрофии Дюшенна и Беккера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, сахарный диабет 1 типа, синдром Дауна / трисомия 21 и спинальная мышечная атрофия. 47–49 ИПСК, созданные из пациентов, у которых диагностировано конкретное генетически наследуемое заболевание, затем могут быть использованы для моделирования патологии заболевания. Например, ИПСК, созданные из фибробластов кожи, взятых у ребенка со спинальной мышечной атрофией, были использованы для создания двигательных нейронов, которые демонстрировали избирательные дефициты по сравнению с нейронами, полученными у здоровой матери ребенка. 48 Поскольку ИПСК проливают свет на развитие нормальных и патологических тканей, специфичных для конкретных заболеваний, ожидается, что открытия, сделанные с использованием этих клеток, послужат основой для будущих разработок лекарств или других терапевтических вмешательств.

Одним особенно привлекательным аспектом ИПСК является то, что теоретически они могут быть направлены на дифференциацию в определенную линию, которая будет поддерживать лечение или регенерацию ткани. Таким образом, соматические клетки пациента с сердечно-сосудистым заболеванием могут быть использованы для генерации ИПСК, которые затем могут быть направлены на создание функциональных взрослых сердечных мышечных клеток (кардиомиоцитов), которые заменяют пораженную ткань сердца, и так далее. Тем не менее, хотя ИПСК имеют большой потенциал в качестве источников зрелых клеток, многое еще предстоит узнать о процессах, посредством которых эти клетки дифференцируются.Например, ИПСК, созданные из человеческих 50 и мышиных фибробластов 51-53 , могут давать функциональные кардиомиоциты, которые демонстрируют характерные сердечные потенциалы действия. Однако процесс созревания кардиомиоцитов нарушается при использовании ИПСК — сердечное развитие ИПСК задерживается по сравнению с кардиомиоцитами, полученными из ЭСК или ткани плода. Кроме того, существует вариация в экспрессии генетических маркеров в кардиальных клетках, происходящих из ИПСК, по сравнению с таковой в кардиомиоцитах, происходящих из ЭСК.Следовательно, кардиомиоциты, полученные из ИПСК, демонстрируют нормальную приверженность, но нарушенное созревание, и неясно, вызваны ли наблюдаемые дефекты техническими (например, неполное перепрограммирование ИПСК) или биологическими барьерами (например, функциональными нарушениями из-за генетических факторов). Таким образом, прежде чем эти клетки можно будет использовать для терапии, будет критически важно различать фенотипы, специфичные для ИПСК и специфичные для заболевания.

Однако следует отметить, что эта развивающаяся область постоянно развивается; дополнительные базовые исследования ИПСК потребуются параллельно с разработкой моделей заболеваний.Хотя технология перепрограммирования, создающая ИПСК, в настоящее время несовершенна, эти клетки, вероятно, повлияют на будущую терапию, а «несовершенные» клетки могут пролить свет на многие области, связанные с регенеративной медициной. Однако клетки, полученные из ИПСК, которые будут использоваться для терапии, потребуют обширной характеристики относительно того, что является достаточным для поддержки исследований моделирования заболеваний. С этой целью исследователи начали использовать методы визуализации для наблюдения за клетками, которые подвергаются перепрограммированию, чтобы отличить истинные ИПСК от частично перепрограммированных клеток. 54 Возможность образования опухоли также должна быть полностью рассмотрена, прежде чем любые производные ИПСК можно будет рассматривать для применяемой клеточной терапии. Кроме того, в предлагаемых применениях аутологической терапии соматические мутации ДНК (например, ненаследственные мутации, накопленные в течение жизни человека), сохраняемые в ИПСК и их производных, могут потенциально влиять на последующие клеточные функции или способствовать образованию опухоли (проблема, которая может быть можно обойти путем создания ИПСК из «молодого» источника клеток, такого как пуповинная кровь). 55 Окажутся ли эти проблемы значимыми при сравнении с терапевтическим потенциалом клеток, еще предстоит определить. Несмотря на большие перспективы ИПСК, нынешний уровень понимания биологии, изменчивости и полезности клеток также должен значительно повыситься, прежде чем ИПСК станут стандартными инструментами регенеративной медицины.

Вывод

С момента своего открытия четыре года назад индуцированные плюрипотентные стволовые клетки захватили воображение исследователей и клиницистов, стремящихся разработать терапию для конкретных пациентов.Перепрограммирование взрослых тканей в эмбрионоподобные состояния имеет бесчисленное множество перспективных применений в регенеративной медицине, разработке лекарств и фундаментальных исследованиях стволовых клеток и процессов развития. На данный момент поиск в PubMed, проведенный в апреле 2010 года с использованием термина «индуцированные плюрипотентные стволовые клетки» (который был введен в обращение в 2006 году), дал более 1400 публикаций, что свидетельствует об очень активной и быстро развивающейся области исследований.

Тем не менее, многие технические и фундаментальные научные проблемы остаются до того, как обещания, предлагаемые технологией iPSC, могут быть полностью реализованы.Для предполагаемых применений в регенеративной медицине безопасность пациента является превыше всего. Необходимо разработать стандартизованные методы для характеристики ИПСК и их производных. Кроме того, перепрограммирование продемонстрировало доказательство принципа действия, но в настоящее время этот процесс слишком неэффективен для рутинного клинического применения. Таким образом, раскрытие молекулярных механизмов, управляющих перепрограммированием, является важным первым шагом на пути к стандартизации протоколов. Понимание молекулярных основ этого процесса прольет свет на различия между ИПСК и ЭСК (и определит, являются ли эти различия клинически значимыми).Более того, по мере того, как исследователи углубляются в эту область, влияние популяций донорских клеток можно сравнить с поддержкой конкретного приложения; т.е. производят ли ИПСК мышечного происхождения больше мышц, чем клеток кожи? Основываясь на захватывающих разработках в этой области на сегодняшний день, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, вероятно, будут поддерживать будущие терапевтические вмешательства либо напрямую, либо в качестве исследовательских инструментов для создания новых моделей дегенеративных заболеваний, которые будут использоваться при разработке лекарств. Хотя еще многое предстоит узнать в области исследований ИПСК, разработка методов перепрограммирования представляет собой прорыв, который в конечном итоге откроет много новых направлений исследований и терапии.

Список литературы

  1. Французский AJ, Адамс CA, Андерсон LS, Кухня JR, Hughes MR, Wood SH. Развитие клонированных бластоцист человека после переноса ядра соматических клеток (SCNT) взрослыми фибробластами. Стволовые клетки. 2008; 26: 485-483.
  2. Бирн Дж. А., Педерсен Д. А., Клеппер Л. Л. и др. Производство эмбриональных стволовых клеток приматов путем переноса ядра соматических клеток. Природа. 2007; 450: 497-502.
  3. Hurlbut WB. Этика и исследование эмбриональных стволовых клеток: изменение переноса ядер как путь вперед.Биопрепараты. 2007; 21: 79-83.
  4. Meissner A, Jaenisch R. Получение плюрипотентных ES-клеток, полученных с переносом ядра, из клонированных бластоцист с дефицитом Cdx2. Природа. 2006; 439: 212-215.
  5. Канц Т., Блейдиссель М., Стеллинг М., Шёлер Х.Р. In vitro дифференцировка перепрограммированных соматических клеток мыши в клетки-предшественники печени. Biol Chem. 2008; 389: 889-896.
  6. Cowan CA, Atienza J, Melton DA, Eggan K. Ядерное перепрограммирование соматических клеток после слияния с человеческими эмбриональными стволовыми клетками.Наука. 2005; 309: 1369-1373.
  7. Такахаши К., Яманака С. Индукция плюрипотентных стволовых клеток из культур эмбриональных и взрослых фибробластов мыши с помощью определенных факторов. Cell. 2006; 126: 663-676.
  8. Махерали Н., Шридхаран Р., Се В. и др. Непосредственно перепрограммированные фибробласты демонстрируют глобальное эпигенетическое ремоделирование и широкое распространение ткани. Стволовая клетка. 2007; 1: 55-70.
  9. Такахаши К., Танабе К., Охнуки М. и др. Индукция плюрипотентных стволовых клеток из фибробластов взрослого человека определенными факторами.Cell. 2007; 131: 1-12.
  10. Ю. Дж., Водяник М. А., Смуга-Отто К. и др. Линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученные из соматических клеток человека. Наука. 2007; 318: 1917-1920.
  11. Лю Х., Чжу Ф., Юн Дж. И др. Генерация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из фибробластов взрослых макак-резусов. Стволовая клетка. 2008; 3: 587-590.
  12. Ляо Дж., Цуй С., Чен С. и др. Создание индуцированных линий плюрипотентных стволовых клеток из клеток взрослых крыс. Стволовая клетка. 2009; 4: 11-15.
  13. Ли В., Вэй В., Чжу С. и др. Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток крысы и человека путем сочетания генетического репрограммирования и химических ингибиторов. Стволовая клетка. 2009; 4: 16-19.
  14. Брамбринк Т., Форман Р., Уэлстед Г.Г. и др. Последовательная экспрессия маркеров плюрипотентности при прямом репрограммировании соматических клеток мыши. Стволовая клетка. 2008; 2: 151-159.
  15. Stadtfeld M, Maherali N, Breault DT, Hochedlinger K. Определение молекулярных краеугольных камней во время репрограммирования фибробластов в iPS-клетки у мышей.Стволовая клетка. 2008; 2: 230-240.
  16. Махерали Н., Ахфельдт Т., Ригамонти А., Утикал Дж., Коуэн С., Хочедлингер К. Высокоэффективная система для создания и изучения индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток. Стволовая клетка. 2008; 3: 340-345.
  17. Аасен Т., Рая А., Барреро М.Дж. и др. Эффективное и быстрое создание индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из кератиноцитов человека. Nat Biotechnol. 2008; 26: 1276-1284.
  18. Schöler HR. Комментарий: Акцент на исследованиях стволовых клеток.Biol Chem. 2008; 389: 789.
  19. Аой Т., Яэ К., Накагава М. и др. Генерация плюрипотентных стволовых клеток из клеток печени и желудка взрослых мышей. Наука. 2008; 321: 699-702.
  20. Фэн Б., Цзян Дж., Краус П. и др. Репрограммирование фибробластов в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки с орфанным ядерным рецептором Esrrb. Nat Cell Biol. 2009; 11: 197-203.
  21. Wernig M, Meissner A, Cassady JP, Jaenisch R. c-Myc незаменим для прямого репрограммирования фибробластов мыши.Стволовая клетка. 2008; 2: 10-12.
  22. Хуанфу Д., Осафуне К., Маер Р. и др. Индукция плюрипотентных стволовых клеток из первичных фибробластов человека только с Oct4 и Sox2. Nat Biotechnol. 2008; 26: 1269-1275.
  23. Hester ME, Song S, Miranda CJ, Eagle A, Schwartz PH, Kaspar BK. Двухфакторное перепрограммирование нервных стволовых клеток человека в плюрипотентность. PLoS One. 2009; 4: e7044.
  24. Ким Дж. Б., Заерес Х., Ву Г. и др. Плюрипотентные стволовые клетки, индуцированные из взрослых нервных стволовых клеток путем перепрограммирования с двумя факторами.Природа. 2008; 454: 646-650.
  25. Ким Дж. Б., Себастьяно В., Ву Г. и др. Oct4-индуцированная плюрипотентность во взрослых нервных стволовых клетках. Cell. 2009; 136: 411-419.
  26. Ким Дж. Б., Гребер Б., Араузо Браво М. Дж. И др. Прямое перепрограммирование нервных стволовых клеток человека к Oct4. Природа. 2009; 461: 649-653.
  27. Фэн Б., Нг Дж. Х., Хэн Дж. К., Нг Х. Х. Молекулы, которые способствуют или усиливают перепрограммирование соматических клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. Стволовая клетка. 2009; 4: 301-312.
  28. Штадтфельд М., Хохедлингер К. Бесследно? PiggyBac-ing к плюрипотентности. Нат методы. 2009; 6: 329-330.
  29. Stadtfeld M, Nagaya M, Utikal J, Weir G, Hochedlinger K. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, полученные без вирусной интеграции. Наука. 2008; 322: 945-949.
  30. Пейдж Р.Л., Амбади С., Холмс В.Ф. и др. Индукция экспрессии генов стволовых клеток в фибробластах взрослого человека без трансгенов. Клонирование стволовых клеток. 2009; 11: 1-10.
  31. Окита К., Накагава М., Хёнджонг Х., Ичисака Т., Яманака С.Создание индуцированных мышами плюрипотентных стволовых клеток без вирусных векторов. Наука. 2008; 322: 949-953.
  32. Юса К., Рад Р., Такеда Дж., Брэдли А. Генерация безтрансгенных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток мыши транспозоном piggyBac. Нат методы. 2009; 6: 363-369.
  33. Утикал Дж., Поло Дж. М., Штадтфельд М. и др. Иммортализация устраняет препятствия во время перепрограммирования клеток в iPS-клетки. Природа. 2009; 460: 1145-1148.
  34. Эминли С., Фоуди А., Штадтфельд М. и др.Стадия дифференцировки определяет потенциал гемопоэтических клеток для репрограммирования в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. Нат Жене. 2009; 41: 968-976.
  35. Ко К., Тапиа Н., Ву Г. и др. Индукция плюрипотентности во взрослых унипотентных стволовых клетках зародышевой линии. Стволовая клетка. 2009; 5: 87-96.
  36. Sommer CA, Stadtfeld M, Murphy GJ, Hochedlinger K, Kotton DN, Mostoslavsky G. Индуцированная генерация плюрипотентных стволовых клеток с использованием одной кассеты лентивирусных стволовых клеток. Стволовые клетки.2009; 27: 543-549.
  37. Kang L, Wang J, Zhang Y, Kou Z, Gao S. iPS-клетки могут поддерживать полноценное развитие тетраплоидных эмбрионов с бластоцистами. Стволовая клетка. 2009; 5: 135-138.
  38. Чжао XY, Li W, Lv Z и др. iPS-клетки продуцируют жизнеспособных мышей за счет тетраплоидной комплементации. Природа. 2009; 461: 86-90.
  39. Армстронг Л., Тилгнер К., Сарецки Г. и др. Линии индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток демонстрируют аналогичные механизмы защиты от стресса и митохондриальную регуляцию с эмбриональными стволовыми клетками человека.Стволовые клетки. 2010; 13 января [Epub перед печатью].
  40. Чин М.Х., Мейсон М.Дж., Се В. и др. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки и эмбриональные стволовые клетки различаются по сигнатурам экспрессии генов. Стволовая клетка. 2009; 5: 111-123.
  41. Дэн Дж., Шумейкер Р., Се Б. и др. Целенаправленное бисульфитное секвенирование выявляет изменения в метилировании ДНК, связанные с ядерным репрограммированием. Nat Biotechnol. 2009; 27: 353-360.
  42. Doi A, Park I-H, Wen B и др. Дифференциальное метилирование берегов CpG-острова, специфичных для тканей и рака, отличает индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки, эмбриональные стволовые клетки и фибробласты.Нат Жене. 2009; 41: 1350-1353.
  43. Миккельсен Т.С., Ханна Дж., Чжан Х и др. Карты метилирования ДНК в масштабе генома плюрипотентных и дифференцированных клеток. Природа. 2008; 454: 794.
  44. Колман А., Дрессен О. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки и стабильность дифференцированного состояния. EMBO Reports. 2009; 10: 714-721.
  45. Ху Б., Вейк Дж. П., Ю. Дж. И др. Нейронная дифференцировка индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток следует принципам развития, но с переменной эффективностью.Proc Natl Acad Sci USA. 2010; 107: 4335-4340.
  46. Бутани Н., Брэди Дж. Дж., Дамиан М., Сакко А., Корбел С.Ю., Блау Х.М. Перепрограммирование в сторону плюрипотентности требует AID-зависимого деметилирования ДНК. Природа. 2010; 463: 1042-1048.
  47. Димос Дж. Т., Родольфа К. Т., Ниакан К. К. и др. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, полученные от пациентов с БАС, можно дифференцировать в двигательные нейроны. Наука. 2008; 321: 1218-1221.
  48. Эберт А.Д., Ю. Дж., Роуз Ф. Ф. младший и др. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки пациента с мышечной атрофией позвоночника.Природа. 2009; 457: 277-280.
  49. Park I-H, Arora N, Huo H и др. Плюрипотентные стволовые (iPS) клетки, индуцированные специфическим заболеванием. Cell. 2008; 134: 877-886.
  50. Чжан Дж., Уилсон Г.Ф., Соеренс А.Г. и др. Функциональные кардиомиоциты, полученные из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток. Circ Res. 2009; 104: e30-e41.
  51. Мауриц С., Шванке К., Реппель М. и др. Генерация функциональных сердечных миоцитов мышей из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Циркуляционный. 2008; 118: 507-517.
  52. Кузьменкин А., Лян Х., Сюй Г. и др. Функциональная характеристика кардиомиоцитов, полученных из индуцированных мышами плюрипотентных стволовых клеток in vitro. FASEB J. 2009; 23: 4168–4180.
  53. Пфаннкуче К., Лян Х., Ханнес Т. и др. Сердечные миоциты, полученные из перепрограммированных фибробластов мышей: интактная гормональная регуляция, экспрессия сердечных ионных каналов и развитие сократимости. Cell Physiol Biochem. 2009; 24: 73-86.
  54. Чан Э.М., Ратанасиринтравут С., Парк И-Н и др.Визуализация живых клеток позволяет отличить настоящие iPS-клетки человека от частично перепрограммированных клеток. Nat Biotechnol. 2009; 27: 1033-1037.
  55. Хаасе А., Ольмер Р., Шванке К. и др. Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из пуповинной крови человека. Стволовая клетка. 2009; 5: 434-441.

Figure 10.1 illustrates a general method for creating induced pluripotent stem cells (iPSCs). At the left, a circular DNA plasmid is used to carry 4 reprogramming factors into the nucleus (shown as a green spherical structure with purple outgrowths on its surface) of a somatic cell (shown in green). The somatic cell is then reprogrammed, and the next step shows that it has changed from an elongated fibroblast-like shape to instead be a rounded, immature type of cell. The final step shows that if cultured as per human embryonic stem cells (hESCs), then a pluripotent iPSC line is produced. Глава 9 | Содержание | Глава 11 Figure 10.1 illustrates a general method for creating induced pluripotent stem cells (iPSCs). At the left, a circular DNA plasmid is used to carry 4 reprogramming factors into the nucleus (shown as a green spherical structure with purple outgrowths on its surface) of a somatic cell (shown in green). The somatic cell is then reprogrammed, and the next step shows that it has changed from an elongated fibroblast-like shape to instead be a rounded, immature type of cell. The final step shows that if cultured as per human embryonic stem cells (hESCs), then a pluripotent iPSC line is produced.

.

Обзор плюрипотентных стволовых клеток

1. Введение

Эта книга называется Плюрипотентные стволовые клетки (PSCs), и различные участники написали о различных аспектах PSC. Но я потерплю неудачу как редактор этой книги, если не обращу внимание читателя на все источники PSC (рис. 1).

Рис. 1.

Потенциальные источники плюрипотентных стволовых клеток

Профессор Томсон и профессор Гирхарт опубликовали в 1998 году важные статьи, в которых они опубликовали вывод PSC из внутренней клеточной массы запасной бластоцисты человека [1] и из ранних зародышевых клеток плода [2 ] соответственно.Недавно профессор Яманака был удостоен Нобелевской премии по медицине за разработку протоколов репрограммирования соматических клеток до эмбрионального состояния с помощью 4 факторов [3, 4]. Помимо этого, есть несколько статей, в которых сообщается о получении ES-подобных колоний из биопсий яичек взрослых мышей [5, 6] и мужчин [7-10]. Аналогичным образом Gong et al [11] сообщили о ES-подобной культуре с использованием ткани яичника. Существует огромное количество литературы, предполагающей, что мезенхимальные стволовые клетки (МСК) обладают плюрипотентными характеристиками и могут трансдифференцироваться [12].Мы недавно опубликовали, что половые железы взрослых [13, 14], пуповинная кровь / ткань, костный мозг [15] и т. Д. Содержат субпопуляцию плюрипотентных стволовых клеток аналогичного типа, называемых очень маленькими эмбрионоподобными стволовыми клетками (VSEL). Мы также разработали случай для VSEL, которые могут приводить к образованию ES-подобных колоний, а не к де-дифференцировке сперматогониальных стволовых клеток в плюрипотентное состояние [16]. Более того, VSEL запутали сферу MSC, поскольку они всегда присутствуют как подгруппа среди MSC, но остаются незамеченными, а плюрипотентные свойства были присвоены MSC неправильно.В настоящее время VSEL не получили широкого распространения, но было показано, что они имеют многообещающее применение в регенеративной медицине.

Таким образом, цель данной главы — познакомить читателей с последними достижениями в области эмбриональных стволовых клеток, индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и VSEL, которые имеют максимальный потенциал для использования в клеточной терапии.

2. Эмбриональные стволовые клетки

Эмбриональные стволовые клетки (ES), как следует из названия, происходят из эмбрионов, а точнее, из внутренней клеточной массы (ICM) бластоцисты.ES-клетки характеризуются двумя отличительными свойствами, а именно: самообновлением — способностью к неограниченному размножению и плюрипотентностью — способностью давать начало клеткам всех трех линий зародышевого эмбриона, таких как эктодерма, мезодерма и энтодерма. Они обладают высоким нуклео-цитоплазматическим соотношением и теломеразной активностью. ES-клетки проявляют высокую активность эндогенной щелочной фосфатазы и экспрессируют несколько ядерных и поверхностных маркеров плюрипотентности. Они имеют тенденцию группироваться вместе при культивировании в суспензии на неприлипающей поверхности с образованием трехмерных агрегатов, известных как эмбриоидные тельца, которые могут быть простыми или кистозными.Более того, они образуют тератомы при инъекции мышам с иммунодефицитом (SCID), являются клоногенными и способны продуцировать химеры при инъекции в бластоцисты на модели мышей.

3. ES-клетки мыши

ES-клетки были впервые получены из ICM эмбрионов на стадии бластоцисты мыши [17, 18]. Помимо ICM бластоцистных мышей ES (mES) клетки также были получены из эмбрионов на стадии дробления и даже из биопсированных отдельных бластомеров эмбрионов на стадии от двух до восьми клеток [19-21]. В общем, mES-клетки можно культивировать на слое митотически неактивных эмбриональных фибробластов мыши (MEF) в присутствии сыворотки и фактора ингибирования лейкемии (LIF).Цитокин LIF поддерживает функции самообновления и плюрипотентности mES-клеток. LIF, растворимый гликопротеин цитокинов семейства интерлейкинов (IL) -6, действует через связывание с гетеродимерами LIF-рецептора и сигнального преобразователя gp130, что приводит к активации передачи сигналов STAT3 [22-24]. В отсутствие сыворотки LIF не способен поддерживать плюрипотентность mES-клеток; однако в сочетании с костным морфогенетическим белком-4 (BMP4) предотвращает дифференцировку mES-клеток [25]. BMP4 индуцирует экспрессию генов Id (ингибитор дифференцировки) через путь Smad.Сверхэкспрессия Id действительно делает возможным пролиферацию mES-клеток в присутствии LIF и без необходимости в BMP4 или сыворотке.

4. Человеческие ES-клетки

Прорыв произошел с получением человеческих ES (hES) клеток в 1998 году [1]. С момента первого сообщения о получении клеточных линий hES во всем мире было получено по крайней мере 1071 клеточная линия hES [26]. Помимо запасных человеческих бластоцист, клеточные линии hES были также получены из эмбрионов на стадии морулы [27], аномально развивающихся и задержанных эмбрионов [28], отдельных бластомеров эмбрионов на 8-клеточной стадии [29] и эмбрионов на 4-клеточной стадии [30, 31]. ].Митотически инактивированные питающие клетки и среда, содержащая сыворотку, вместе с основным фактором роста фибробластов (bFGF) обычно используются для поддержания клеток hES. LIF и родственные ему цитокины неспособны поддерживать клетки hES в среде, содержащей сыворотку, которая поддерживает клетки mES, несмотря на существование функционального пути передачи сигналов LIF / STAT3 в клетках hES [1, 32, 33]. В отличие от mES-клеток, передача сигналов FGF и TGF / Activin / Nodal важна для самообновления hES-клеток [34]. Хотя элементы пути BMP существуют в клетках hES [35], но в отличие от клеток mES, BMP, добавленные к клеткам hES в условиях, которые в противном случае поддерживали бы самообновление, вызывают быструю дифференцировку [36].Недавние исследования выявили множественные взаимодействия между путями FGF, TGFβ и BMP в клетках hES. Активин индуцирует экспрессию bFGF [37], а bFGF индуцирует экспрессию Tgfβ1 / TGFβ1 и Grem1 / GREM1 (антагонист BMP) и ингибирует экспрессию Bmp4 / BMP4 как в питающих фибробластах, так и в клетках hES [38].

Несмотря на то, что они схожи по своим характеристикам, таким как экспрессия Oct-4, Nanog, активность щелочной фосфатазы, образование эмбриоидных телец, образование тератом, между клетками mES и клетками hES существуют некоторые потенциальные различия.В отличие от mES-клеток, которые демонстрируют экспрессию SSEA-1, hES-клетки экспрессируют SSEA-3/4, TRA-1-60 / 81. Кроме того, среднее время удвоения популяции для hES-клеток больше по сравнению с mES-клетками (30-35 часов против 12-15 часов).

5. Культивирование in vitro и дифференцировка hES-клеток

Хотя клеточные линии hES впервые были получены на питающих слоях MEF, постоянные усилия по разработке безксено-свободной культуральной системы привели к созданию кормушек человека, полученных из эпителия маточных труб [ 39], крайняя плоть плода, мышцы [40, 41] или амниотический эпителий [42].Были предприняты попытки получить новые клеточные линии hES в более определенных условиях, включая условия без сыворотки или питателя в присутствии внеклеточных матриц, таких как матригель и фибронектин [43-45]. Crook et al [46] получили шесть линий клеток hES клинического уровня, используя кормушку для человека GMP, выращенную в среде с FBS качества GMP, и размножили линии клеток, используя формулировку GMP для замены нокаутной сыворотки (KO-SR). Несмотря на то, что эти клеточные линии не свободны от ксено, они соответствуют клиническому качеству. Сидху и др. [47] сообщили о получении клеточной линии hES в культуре с использованием покрытых человеческим коллагеном планшетов и KO-SR для поддержания фибробластов человека.Была описана полностью определенная среда, свободная от ксенонов (RegES), способная поддерживать рост клеточных линий hES, индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток и жировых стволовых клеток [48]. Недавно Wang и др. [49] разработали культуральную систему без ксенонов и питающих клеток для размножения клеток hES и клеток hiPS с использованием плазмы человека и экстрактов плаценты человека.

ES-клетки человека обладают способностью образовывать в нашем организме 200 с лишним типов клеток. По сути, ES-клетки могут дифференцироваться спонтанно путем образования эмбриоидных тел или путем направленной дифференцировки с использованием смеси факторов роста.Было показано, что несколько факторов роста направляют дифференцировку ES-клеток, а именно активин-A и трансформирующий фактор роста (TGF-β1) в основном индуцируют мезодермальные клетки; ретиноевая кислота (RA), эпидермальный фактор роста (EGF), BMP-4 и bFGF активируют эктодермальные и мезодермальные клетки; β-фактор роста нервов (NGF) и фактор роста гепатоцитов (HGF) дифференцируют все три эмбриональных зародышевых листка [50-53]. Направленная дифференцировка — это более контролируемый процесс, включающий последовательное добавление индукторов и ингибиторов роста на конкретных стадиях, которые, как известно, влияют на ключевые пути.Например, активин A и BMP4 — два таких фактора роста, которые широко используются для кардиогенной дифференцировки. Различные исследования показали, что клетки hES можно дифференцировать в нейрональную [54], гематопоэтическую [55], эндотелиальную [56], мышечную [57], сердечную [58, 59], поджелудочную [60, 61], печеночную [62] линии. Хотя линии стволовых клеток hES схожи в отношении самообновления и экспрессии маркеров плюрипотентности, опубликованная литература, тем не менее, предполагает, что они обнаруживают различия в своей способности к дифференцировке в идентичных условиях культивирования [63, 64].

6. Возможное использование ES-клеток

Замечательные особенности hES-клеток послужили важным прорывом в фундаментальных исследованиях и имеют большой потенциал для регенеративной медицины. ES-клетки могут выступать в качестве ключевых инструментов исследования для понимания сложных событий, происходящих во время эмбрионального развития, которые могут объяснить причины врожденных дефектов. Они являются идеальными кандидатами для изучения апоптоза на ранней стадии эмбриона, механизма дифференцировки, мутагенеза, иммунного отторжения и старения.Человеческие ES-клетки и их производные могут использоваться для тестирования терапевтической эффективности и токсичности лекарственного средства. Они также широко применяются в тканевой инженерии. Сообщается, что после их культивирования на полимерном каркасе стволовые клетки заставляют формировать ткани с характеристиками развивающихся хрящей, печени, нейронов и кровеносных сосудов человека.

Несмотря на то, что они связаны с риском индукции тератом и иммунного отторжения, жизненно важным потенциалом применения hES-клеток является создание клеток и тканей, которые могут использоваться для клеточной терапии.Человеческие ES-клетки, направленные на дифференциацию в определенные типы клеток, предлагают возможность возобновляемого источника замещающих клеток и тканей для лечения множества заболеваний и нарушений, включая болезни Паркинсона и Альцгеймера, травмы спинного мозга, ожоги, сердечную недостаточность и диабет и т. Д. Одобренное FDA клиническое исследование безопасности фазы 1 началось с клеток-предшественников олигодендроцитов GRNOPC1, полученных из Geron (Menlo Park, Калифорния, США), для лечения полного повреждения спинного мозга на грудном уровне [65].Первоначально исследование было приостановлено из-за появления микроскопических кист при трансплантации животных, но позже было одобрено [66, 67]. Однако в ноябре 2011 года Geron отказался от исследований стволовых клеток по финансовым причинам и заявил, что продолжит наблюдение за существующими пациентами и пытается найти партнера, который мог бы продолжить их исследования. Недавний успех проспективного клинического исследования Advanced Cell Technology (Калифорния и Массачусетс, США) по установлению безопасности и переносимости субретинальной трансплантации пигментного эпителия сетчатки (RPE), полученного из hES-клеток, у пациентов с макулярной дистрофией Штаргардта (SMD) и сухой Возрастная дегенерация желтого пятна (Сухая AMD) представляет собой важный шаг на пути к терапевтическому использованию hES-клеток [68].Хотя долгосрочное наблюдение имеет важное значение, а глаз — это иммунная привилегия; по-прежнему обнадеживает то, что после 4 месяцев трансплантации нет ассоциированных признаков гиперпролиферации, онкогенности, формирования эктопической ткани или иммунного отторжения.

7. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки

Основным прогрессом в области стволовых клеток стало создание индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPS) путем перепрограммирования соматических клеток в состояние эмбриональных стволовых клеток с использованием смеси факторов транскрипции.В 2006 году Takahashi и Yamanaka перепрограммировали фибробласты мыши с помощью ретровирусной трансдукции с 24 генами-кандидатами [3]. Пул генов постепенно сокращался до четырех факторов транскрипции: Oct4, Sox2, c-Myc и Klf4. Результаты были быстро подтверждены различными исследователями [69–71]. Вскоре технология была успешно применена для получения iPS-клеток из фибробластов человека [4, 72, 73]. Одновременно другая группа определила Oct4, Sox2, Nanog и Lin28 как достаточные для репрограммирования человеческих клеток, при этом Oct4 и Sox2 оказались важными, а два других фактора либо сильно (Nanog), либо умеренно (Lin28) влияли на эффективность репрограммирования [74] ,

Различные способы получения iPS-клеток мыши и человека с использованием различных факторов репрограммирования были хорошо обобщены Махерали и Хочедлингером [75] и Кискинисом и Эгганом [76]. Выбор системы доставки генов является ключевым аспектом для создания iPS-клеток и был очень хорошо рассмотрен Oh et al [77]. Многие исследователи сообщают об использовании интегрирующих вирусных векторов, таких как ретровирусные [4, 73, 78] и лентивирусные векторы [74, 79], неинтегрирующие вирусные векторы, такие как аденовирусные [80] и Сендаивирусные векторы [81], невирусные методы, такие как плазмидная ДНК [82], транспозоны piggyBac [83, 84], рекомбинантные белки [85, 86], мРНК [87] и небольшие молекулы, такие как вальпроевая кислота [88].Более того, получение iPS-клеток от пациентов, страдающих нейродегенеративным заболеванием боковым амиотрофическим склерозом (БАС) [89], а также пациентов с другими заболеваниями, включая ювенильный сахарный диабет 1 типа, болезнь Паркинсона (БП) [90] и мышечные спины. сообщалось об атрофии (СМА) [91].

8. Преимущества и недостатки iPS-клеток

В качестве потенциального применения в клеточной терапии одним из основных преимуществ iPS-клеток является предотвращение иммунного отторжения, поскольку они происходят из собственных клеток пациента, а также этические нормы. вопросы, связанные с использованием человеческих эмбрионов.Более того, iPS-клетки сходны с ES-клетками во многих аспектах, включая морфологию клеток, экспрессию маркеров плюрипотентности, длинные теломеры и способность образовывать эмбриоидные тельца, тератомы и жизнеспособные химеры [92, 93]. Помимо использования в клеточной терапии, iPS-клетки, полученные от пациентов с заболеванием, могут служить эффективной моделью для понимания механизмов заболеваний.

Однако использование iPS-ячеек имеет ряд недостатков и в основном связаны с современными методами перепрограммирования. Вирусные векторы, используемые для доставки генов, привели к интеграции множества вирусов в геномы iPS-клеток, что привело к онкогенезу из-за генетических аномалий в клетках.Более того, эффективность репрограммирования iPS-клеток человека из фибробластов очень низкая, примерно менее 0,02% [94]. Использование гена Myc в качестве фактора перепрограммирования и / или реактивация заглушенного гена Myc может привести к превращению iPS-клеток в раковые [95].

Недавно три исследования, опубликованные в Nature, показали, что процесс репрограммирования и последующее культивирование iPS-клеток in vitro может вызывать генетические и эпигенетические аномалии в этих клетках. Гор и др. [96] обнаружили в среднем по пять точечных мутаций в каждой проанализированной линии iPS-клеток, при этом большинство мутаций были несинонимичными, бессмысленными или сплайсинговыми вариантами и были обогащены генами, мутировавшими или оказавшими причинные эффекты в раки.Hussein и его коллеги [97] показали, что вариации числа копий (CNVs) происходят с высокой скоростью в процессе репрограммирования, что приводит к генетическому мозаицизму в iPSCs раннего пассажа. Анализ паттернов метилирования CG Lister et al [98] идентифицировал многочисленные дифференциально метилированные области CG (CG-DMRs) между iPS-клетками и ES-клетками. Присутствие основного набора CG-DMR в каждой линии iPS-клеток указывает на горячие точки неудачного эпигеномного репрограммирования. Эти исследования вызывают опасения по поводу последствий таких аберраций для будущих применений iPS-клеток.Для понимания процесса репрограммирования необходимо гораздо более глубокое исследование, а также необходимо изучить биологические последствия этих геномных и эпигеномных изменений.

9. Очень маленькие эмбриональные стволовые клетки

Этические и другие технические вопросы, связанные с использованием ES-клеток в регенеративной медицине, привели к поиску альтернативных стволовых клеток с терапевтическим потенциалом. В этом отношении взрослые стволовые клетки потенциально могут стать терапевтической альтернативой ES- или iPS-клеткам.Хотя известно, что взрослые стволовые клетки являются тканеспецифичными и могут дифференцироваться только в клетки своей ткани, тем не менее, в нескольких исследованиях сообщалось, что взрослые стволовые клетки могут дифференцироваться в клетки совершенно другого происхождения. Этот процесс называется пластичностью взрослых стволовых клеток. Wagers и Weissman предложили несколько потенциальных механизмов и объяснений наблюдаемой пластичности взрослых стволовых клеток [99]. Возможные механизмы включают транс-дифференцировку или де-дифференцировку стволовых клеток, присутствие множества различных стволовых клеток в ткани, присутствие плюрипотентных стволовых клеток в дополнение к взрослым стволовым клеткам и слияние стволовых клеток с клетками другого происхождения.Однако несколько линий доказательств подтверждают существование плюрипотентных стволовых клеток во взрослых тканях, которые могут дифференцироваться во все три линии, что лучше всего объясняет пластичность взрослых. Многие исследователи сообщали о наличии плюрипотентных стволовых клеток в тканях взрослого человека, которые были определены как мезенхимальные стволовые клетки (MSC) [100], мультипотентные взрослые клетки-предшественники (MAPC) [101], изолированные многолинейные индуцибельные клетки взрослого мозга (MIAMI) [102]. , мультипотентные взрослые стволовые клетки (MASC) [103], очень маленькие эмбриональные стволовые клетки (VSEL) [104].Хотя эти клетки могут представлять собой перекрывающийся тип стволовых клеток, наиболее характерными среди этих клеток на уровне отдельных клеток являются VSEL, и они были выделены и идентифицированы в нескольких органах взрослого организма.

VSEL определяются как стволовые клетки, происходящие из эпибласта, которые откладываются на ранних этапах органогенеза и могут служить источником стволовых клеток, связанных с тканью. Плюрипотентные VSEL (Oct4 + , SSEA1 + , Sca1 + , Lin , CD45 ) были впервые описаны Ratajczak и группой в различных тканях взрослых мышей [105]; самые высокие количества находятся в головном мозге, почках, мышцах, поджелудочной железе и костном мозге [106].Это диплоидные клетки с высокой теломеразной активностью, экспрессирующие другие плюрипотентные (Rex-1, Nanog, SSEA и Klf-4) маркеры и маркеры половых клеток (Mvh, Stella, Fragilis, Nobox и Hdac-6) и уменьшающиеся с возрастом [107 ]. Важным доказательством плюрипотентности VSELs является гипометилированный статус промотора OCT-4 и его ассоциация с гистонами, способствующими транскрипции [108], а также наличие двухвалентных доменов [109]. Как и эмбриональные стволовые клетки, они не экспрессируют антигены MHC класса I и HLA-DR, а также отрицательны по маркерам мезенхимальных стволовых клеток, таким как CD90, CD105, CD29.Они очень маленькие по размеру (3-5 мкм у мышей), имеют большое нуклео-цитоплазматическое соотношение и открытую структуру хроматина для промотора OCT-4 и Nanog [107]. Экспрессия OCT-4 на уровне мРНК и белка в VSEL была подтверждена с использованием праймеров, специфичных для последовательности. VSELs обладают способностью дифференцироваться в три зародышевых листка in vitro , однако, в отличие от ES клеток, VSELs не комплементарны во время развития бластоцисты и не образуют тератомы у иммунодефицитных мышей [110]. Были предприняты попытки размножить их на питающих слоях, но они не самообновляются так легко, как установленные линии эмбриональных стволовых клеток, возможно, из-за измененного статуса метилирования некоторых важных для развития генов.Подобные VSELs также были выделены из пуповинной крови человека, мобилизованной периферической крови и костного мозга взрослого человека с помощью проточной цитометрии, как CD133 + , lin , CD45 [104], а также методом дифференциального центрифугирования [15, 111].

VSEL являются потомками плюрипотентных стволовых клеток на стадии эпибласта. Они откладываются в различных органах тела, включая гонады, на ранних стадиях развития в виде покоящейся популяции стволовых клеток, которая, возможно, служит резервной копией стволовых клеток, коммитированных тканью (TCSC) [112].Эти две популяции стволовых клеток (VSEL и TCSC) вместе ответственны за обновление тканей, гомеостаз и регенерацию после травм на протяжении всей жизни и уменьшение их количества с возрастом. Недавно было высказано предположение о сосуществовании двух популяций стволовых клеток (более примитивные находятся в состоянии покоя, а предшественники быстрее делятся) [113, 114]. VSEL ​​представляют собой сохраняющие метку ДНК (например, BrdU) покоящиеся стволовые клетки с более низким метаболическим состоянием, тогда как коммитированные в ткани стволовые клетки активно делятся и не сохраняют метку ДНК с течением времени.Они очень подвижны, реагируют на градиент SDF-1 и входят в кровоток в случае любого повреждения, вызывая регенерацию и гомеостаз. Их также считают недостающим звеном в поддержку гипотезы зародышевой линии развития рака [115, 116].

VSEL в пуповинной крови (UCB): Популяция человеческих клеток, аналогичная VSEL, полученным из костного мозга мыши, впервые была описана Kucia et al в пуповинной крови [117]. Эти производные от UCB VSELs (Lin- / CD45- / CD133 +) имеют размер 6-8 мкм, обладают большими ядрами и экспрессируют факторы транскрипции ядерных эмбрионов OCT-4, Nanog и SSEA-4 на поверхности клетки.Стратегия выделения VSEL из пуповинной крови затруднена из-за их небольшого размера, поскольку они выбрасываются вместе с мусором. Недавно наши исследования показали, что VSEL оседают вместе с эритроцитами и не обогащаются межфазным слоем MNC, полученным после разделения фиколла пуповинной крови [15]. Эти VSEL экспрессируют плюрипотентные маркеры OCT-4, примитивный маркер CD133 вместе с маркером примордиальных зародышевых клеток stella и fragilis, что указывает на их эпибластное происхождение. Наши исследования также показали наличие VSEL в отброшенных фракциях костного мозга и пуповинной крови, полученных после обработки [15].

VSELs в гонадах взрослых млекопитающих: Первоначальные исследования, проведенные группой Ratajczak, показали, что семенники мышей содержат VSELs [106]. Наша группа определила присутствие VSEL в семенниках человека и мышей, а также в яичниках человека, овцы, обезьяны, кролика и мышей [13]. Эти VSELs локализуются в базальном слое клеток, прилегающих к базальной мембране в семенных канальцах [13], и были обнаружены вкраплениями с поверхностными эпителиальными клетками яичников [14]. Основной подход к идентификации VSELs в гонадах взрослых млекопитающих включает изучение дифференциальной экспрессии плюрипотентного маркера OCT-4.OCT-4 представляет собой фактор транскрипции, связывающий октамер, необходимый для поддержания плюрипотентности клетки. Опубликованная литература по OCT-4 в соматических стволовых клетках смутила исследователей стволовых клеток [118–120] из-за присутствия нескольких псевдогенов и транскриптов с альтернативным сплайсингом [118, 121]. Таким образом, тщательный дизайн праймеров для анализа RT-PCR и правильный выбор антител становится важным для обнаружения конкретных транскриптов. Также тщательный отбор антител к OCT-4 важен для обнаружения плюрипотентных стволовых клеток [119].Мы использовали поликлональное антитело OCT-4, которое позволило одновременно идентифицировать VSEL с ядерным OCT-4 и тканевыми коммитированными стволовыми клетками с цитоплазматическим OCT-4. Кроме того, тщательный отбор праймеров для OCT-4A и общего OCT-4 для исследований Q-PCR помог нам получить интересные результаты [13-15, 122].

VSELs в семенниках: Мы задокументировали, что яички взрослого человека содержат популяцию плюрипотентных VSEL (с ядерным OCT-4A), которые более примитивны по сравнению с A dark Spermatogonial Stem Cell (SSC) (с цитоплазматическим OCT-4B) ,VSELs, возможно, дают начало SSCs A dark , которые, в свою очередь, подвергаются клональной экспансии, о чем свидетельствует наличие цитоплазматических мостов между быстро делящимися клетками [13]. OCT-4 не иммуно локализуется в более дифференцированных мужских половых клетках. На основании этого исследования была предложена новая иерархия яичек, в которой все тестикулярные клетки происходят от VSEL, а не от SSC, как обычно считается. Аналогичным образом присутствие VSEL, отличных от SSC, также было идентифицировано в ткани яичек мышей.

VSELs в яичниках: Давняя догма женской биологии заключается в том, что женщины и самки других млекопитающих рождаются с фиксированным и необновляющимся пулом половых клеток, которые заключены в структуры, называемые фолликулами. Их количество уменьшается с возрастом из-за овуляции или атрезии, а их истощение приводит к менопаузе. Однако за последние 8 лет несколько исследователей, имеющих доступ к современным молекулярным методам, убедительно продемонстрировали, что яичники взрослых млекопитающих содержат стволовые клетки и подвергаются постнатальному оогенезу, и тем самым бросили вызов центральной догме.Присутствие ПСХ в яичниках взрослых было продемонстрировано многими группами [11, 14, 123, 124]. Наша группа определила два различных типа стволовых клеток в поверхностном эпителии яичников (OSE) человека и других видов млекопитающих [14, 122]. Две стволовые клетки представляют собой VSEL, которые экспрессируют OCT-4 в ядре, которые являются плюрипотентными и немного более крупными клетками-предшественниками (называемыми стволовыми клетками яичников-OGSC), которые экспрессируют OCT-4 цитоплазматически. Это очень похоже на сообщенное присутствие VSELs и сперматогониальных стволовых клеток в семенниках взрослых млекопитающих, как упоминалось ранее.Мы недавно рассмотрели различные публикации о стволовых клетках яичников и объяснили результаты в контексте биологии VSEL [122]. Читателям предлагается прочитать обзор для получения более подробной информации.

На основании наших исследований стволовых клеток яичников и другой литературы мы предложили модель оогенеза и сборки фолликулов в яичниках взрослых млекопитающих [122]. Согласно модели, VSEL с ядерным Oct-4, которые расположены в OSE, подвергаются асимметричному клеточному делению и дают клетки с цитоплазматическим Oct-4 (OGSC, которые интенсивно окрашиваются гематоксилином).OGSCs подвергаются дальнейшей пролиферации, мейозу и дифференцировке для сборки в примордиальные фолликулы в OSE. Клетки гранулезы образуются эпителиальными клетками через эпителиальный мезенхимальный переход. По мере роста и дальнейшего созревания фолликулы переходят в мозговой слой яичника.

10. Клинический потенциал VSEL

Клинический потенциал VSEL, выделенных из пуповинной крови или костного мозга с помощью проточной цитометрии, только начинает проявляться. При различных моделях заболеваний, таких как инфаркт миокарда [125, 126], инсульт [127], ожоговое повреждение кожи [128], регенерация нервов [129] и т. Д.эти клетки мобилизуются в кровоток в течение 24 часов. Для регенерации миокарда VSEL очень эффективны для улучшения фракции выброса ЛЖ и ослабления гипертрофии миокарда [126]. Поскольку с возрастом их становится мало, регенерация становится неэффективной, что приводит к проявлениям возрастных заболеваний.

Выявление VSEL в гонадах имеет далеко идущие последствия для проблем репродуктивного здоровья. Понимание биологии VSEL в гонадах может помочь объяснить механизмы различных патологий гонад и может стать проложением новых методов лечения бесплодия.Тем не менее, применение VSEL для улучшения репродуктивного здоровья требует исследования и внедрения. Мы недавно изучили дифференциальный эффект бусульфана на относительно покоящиеся VSEL по сравнению с быстро делящимися зародышевыми клетками на гонадах взрослых мышей (неопубликованные результаты). Было обнаружено, что VSEL устойчивы к лечению, однако не могли дифференцироваться, вероятно, из-за изменения ниши VSEL в результате лечения. Группа Ратайчака недавно сообщила, что VSEL в костном мозге мышей устойчивы к полному облучению тела [130].Они отметили увеличение количества VSEL после лечения, хотя восстановить костный мозг не удалось. Эти исследования открывают новые и захватывающие возможности для сохранения фертильности у выживших после рака, которые становятся бесплодными из-за различных методов лечения рака.

11. Преимущества VSEL над ES клетками

VSEL могут быть легко получены из аутологичного источника и не образуют легко тератомы [131]. Таким образом, устраняются как основные проблемы, связанные с иммунным отторжением ES-клетками, так и риск образования тератомы.

12. Преимущества VSEL перед iPS-клетками

Нет необходимости перепрограммировать соматические клетки (которые могут содержать мутации) до эмбрионального состояния, когда плюрипотентные ES-подобные стволовые клетки могут быть получены из взрослых тканей. Они также могут превосходить iPS-клетки, поскольку они происходят из очень покоящейся популяции стволовых клеток и, таким образом, являются «молодыми» клетками с длинными теломерами, которые могут быть выделены из старого организма, в отличие от iPS-клеток, которые происходят из терминально дифференцированных соматических клеток. фибробласты кожи (с укороченными теломерами), которые со временем имеют тенденцию накапливать мутации ДНК.Кроме того, у VSEL нет эпигенетических проблем, связанных с iPS-клетками. В отличие от iPS-клеток, вирусные векторы не требуются, и, следовательно, исключается риск трансформации VSEL-клеток в раковые клетки.

13. Перспективы на будущее

Эмбриональные стволовые клетки считаются «волшебными пулями», имеющими большой потенциал для клеточной терапии, однако будущее клиническое использование ES-клеток все еще связано с этическими проблемами. Следовательно, существует острая необходимость в расширении исследований по получению и культивированию плюрипотентных стволовых клеток из альтернативных источников.Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, хотя и считаются идеальными кандидатами, нуждаются в дальнейшем использовании для реализации их клинического потенциала. Принимая во внимание потенциальные преимущества VSEL над ES и iPS-ячейками, потребность в исследованиях для использования потенциала VSEL очень высока. В настоящее время доступность большого количества VSEL для эффективного использования в клинических приложениях ограничена. Исследования продвигаются в направлении распространения VSEL в культуре и все еще находятся на начальной стадии. Кроме того, необходимо ответить на многие ключевые вопросы, прежде чем полностью раскрыть потенциал стволовых клеток.

.

Плюрипотентных стволовых клеток

Автор: Ян Мурнаган, бакалавр (с отличием), магистр наук — Обновлено: 20 декабря 2019 г. | * Обсудить

Концепция стволовых клеток может показаться сложной, и вы, возможно, видели иностранные слова, такие как «плюрипотентный», написанные в журналах или обсуждаемые по телевидению. Стволовые клетки описывают все клетки, которые могут давать начало различным клеткам тканей. Однако существуют разные типы стволовых клеток. Один из таких типов — плюрипотентные стволовые клетки.

Что такое плюрипотентные стволовые клетки?
Плюрипотентные стволовые клетки часто называют «настоящими» стволовыми клетками, потому что они обладают потенциалом дифференцироваться практически в любую клетку организма.Это означает, что при определенных обстоятельствах стволовая клетка, выделенная из эмбриона, может производить почти все клетки организма. Однако после того, как эта стадия эмбрионального развития закончилась, у стволовых клеток больше нет этого неограниченного потенциала для развития во все типы клеток. Таким образом, их плюрипотентность теряется, и они могут стать только определенными типами клеток.
Что делает стволовые клетки плюрипотентными?
Чтобы понять, как клетка становится плюрипотентной, стоит рассмотреть человеческое тело на самых ранних стадиях развития.После оплодотворения яйцеклетки спермой образуется одна клетка. Эта клетка — оплодотворенная яйцеклетка, обладающая тотипотентностью — может создать целый организм. В первые часы и дни после оплодотворения эта единственная тотипотентная клетка делится на большее количество тотипотентных клеток, которые являются точными копиями оригинала.

Примерно через четыре дня после оплодотворения тотипотентные клетки начинают специализироваться и образовывать кластер клеток, известный как бластоциста. Бластоциста имеет еще одну меньшую группу клеток, известную как внутренняя клеточная масса, и именно эти внутренние плюрипотентные стволовые клетки будут создавать большинство клеток и тканей в организме человека.Таким образом, эти плюрипотентные стволовые клетки отличаются от тотипотентных стволовых клеток, поскольку они не развиваются в полноценный организм. Таким образом, плюрипотентная клетка не дает начало плаценте или другим тканям, которые жизненно важны для развития плода. Он по-прежнему будет развиваться в другие специализированные типы клеток человеческого тела, такие как нервные или сердечные клетки.

Возможно, вы слышали термин «линия стволовых клеток». Стволовые клетки эмбрионов могут использоваться для создания этих «линий» плюрипотентных стволовых клеток, которые выращиваются в лаборатории или культивируются из ткани плода.

Типы плюрипотентных стволовых клеток
Существует несколько ключевых типов плюрипотентных стволовых клеток:
  • Эмбриональные стволовые клетки выделяются из внутренней клеточной массы бластоцисты. Эмбрионы — это избыточные, полученные в результате экстракорпорального оплодотворения, но эта практика все еще вызывает споры, потому что она действительно разрушает эмбрион, который мог быть имплантирован для создания ребенка.
  • Эмбриональные половые клетки берут из абортированных плодов, и эти плюрипотентные клетки происходят из очень ранних клеток.Эти ранние клетки могут стать сперматозоидами и яйцеклетками.
  • Эмбриональная карцинома или раковые клетки выделяются из типа опухоли, которая иногда возникает у плода.
Преимущества и будущее плюрипотентных стволовых клеток
Плюрипотентные стволовые клетки дают возможность получить возобновляемый источник здоровых клеток и тканей для лечения широкого спектра заболеваний, таких как болезни сердца и диабет. Жертвы ожогов и те, кто страдает аутоиммунными заболеваниями, такими как болезнь Паркинсона, потенциально могут извлечь выгоду из использования плюрипотентных стволовых клеток.

Плюрипотентные стволовые клетки обладают огромным потенциалом для лечения заболеваний, а именно потому, что они дают начало большинству типов клеток в организме человека. К ним относятся мышцы, кровь, сердце и нервные клетки. Еще одно возможное использование плюрипотентных стволовых клеток включает создание клеток и тканей для трансплантации.

Плюрипотентные стволовые клетки могут развиваться в специализированные клетки, которые в конечном итоге могут заменять больные клетки и ткани. Исследования лекарств — еще одна область, в которой могут быть полезны плюрипотентные стволовые клетки.Животные — это обычно используемая модель для оценки безопасности и использования лекарств. Вместо первоначального тестирования лекарств на животных их можно оценить путем тестирования на клетках, выращенных из плюрипотентных стволовых клеток. Те лекарства, которые кажутся переносимыми и безопасными, затем могут быть протестированы на животных и, наконец, на людях.

Вызовы для плюрипотентных стволовых клеток
Часто открытия с наибольшими терапевтическими преимуществами представляют собой самые сложные проблемы; это особенно верно для плюрипотентных стволовых клеток.Исследователи пытаются изучить способы управления процессом развития плюрипотентных стволовых клеток во множество различных типов клеток человеческого тела. Другая актуальная проблема заключается в том, что клетки, используемые в исследованиях, отторгаются из организма человека из-за его иммунной системы. Более спорным является тот факт, что многие ученые и представители общественности имеют этические проблемы с использованием плюрипотентных стволовых клеток из человеческих эмбрионов или тканей плода.

Положительные применения плюрипотентных стволовых клеток огромны, но необходимо принять во внимание новые исследования и этические проблемы, прежде чем общественность сможет воспользоваться всеми преимуществами.Тем, кто страдает от множества заболеваний, которые можно лечить с помощью плюрипотентных стволовых клеток, мы надеемся, что раньше, чем позже, появятся дополнительные знания и исследования.

Что читать дальше …
Узнайте больше о стволовых клетках и каналах, с которыми сталкивается терапия стволовыми клетками, прочитав нашу статью «Проблемы терапии стволовыми клетками».

Вам также может понравиться …

Поделитесь своей историей, присоединитесь к обсуждению или обратитесь за советом ..

Я благодарен вам за четкое понимание стволовых клеток.Несколько дней назад во время моего исследования я начал бороться за понимание между плюрипотентными и титопотентными стволовыми клетками.

Серджио — 28 июля 19 в 3:21

Как органы развиваются из плюрипотентных клеток?

ME — 13 февраля 18 в 17:40

Привет У меня есть докладчик на медицинской конференции в великобритании Тема моей лекции о производстве органов человека по технологии Я прошу вас предоставить мне все источники о производстве Человеческого производства.

Dr anas — 20 мар.17 в 17:37

Вылечят ли плюрипотентные стволовые клетки вирусы

Рики — 12 фев 16 в 12:22

Вы украли мои данные и концепцию о культуре тотипотентных клеток для раковых клеток., Я доказал и отправил все данные в AIIMS для дальнейшего исследования в сентябре 2014 года, по этой причине я также получил предложение о стипендии от китайского медицинского колледжа .. У меня тоже есть сводка данных на fb ..

dev — 16 сентября 15 в 22:41

Будут ли стволовые клетки эффективны при лечении?

Элейн — 14 августа 15 в 8:16

@ rippa77 — мне жаль это слышать. Однако вам действительно нужно будет поговорить со своим терапевтом о том, предлагается ли какое-либо лечение в этой области.Пока еще очень рано, но исследования проводятся.

ExploreStemCells — 5 августа 15 в 11:38

Привет, я c5 / c6 Травма спинного мозга. Я попал в автомобильную аварию, из-за которой я был прикован к инвалидному креслу, плюс во второй аварии я потерял руку, но это похоже на защемление нервов. Я не знаю, можете ли вы помочь мне или посоветовать кому-то, что, по вашему мнению, может помочь мне или направить меня на правильный путь. Спасибо, Кельвин.

rippa77 — 2 августа 15 в 17:02

Я очень ценю работу, меня хорошо понимают и меня интересуют.Большое спасибо

massawe — 22 мая 15 в 8:46

это очень хорошо, потому что это не дается ни одной книги на хинди

SAN — 4 фев 15 в 14:32

Эта статья была очень полезной. Я одержим исследованиями стволовых клеток и всеми различными методами.

Stemcellgirl1234 — 1 фев 15 в 3:08

Ваша статья вселяет в меня такую ​​надежду. Сэр, мой муж страдает азооспермией. может ли мой муж вылечить терапию стволовыми клетками.Если да, то где я могу пройти это лечение. пожалуйста, помогите мне, сэр.

sri85 — 18 июня 14 в 9:26

Да, есть и другие способы получить стволовые клетки. Они нашли способы получить клетки из спинной ткани, костного мозга и даже жира. Они обнаружили, что большинство, если не все органы и ткани в организме действительно содержат «некоторые» стволовые клетки. у него есть несколько проблем. Во-первых, клетки должны быть плюрипотенциализированы, чтобы тело не отвергало их, и чтобы они могли воспроизводить те типы клеток, которые вы хотите, чтобы они воспроизводились.Кроме того, идентификация и сбор клеток является трудным, дорогостоящим и часто болезненным для донора. Существуют также стволовые клетки пуповины, но их нужно собирать, пока пуповина еще жива, поэтому очень трудно найти доноров для этого. Бластоцисты ЭКО по-прежнему являются наиболее востребованным и используемым источником стволовых клеток.

Micki — 11 мая 14 в 20:20

Есть ли этически понятный способ получения стволовых клеток? Я понимаю, что эмбриональные стволовые клетки — единственный способ в настоящее время, но пытается ли кто-нибудь создать искусственные стволовые клетки, чтобы это не нарушило чью-либо мораль?

JDC — 24 апр 14 в 18:57

По существу объяснение.Спасибо, что разместили все статьи о стволовых клетках, действительно помогли.

саша — 28 мар 14 в 11:37

Я биохимик и адерматолог, интересующийся исследованиями стволовых клеток, у меня были две статьи о человеческом происхождении и индуцированных плюрипотентных стволовых клетках. Я бы поучаствовал в таких исследованиях, если бы у меня была возможность. Спасибо большое.

Elsheihk — 16 июля 13 в 01:14

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, казалось бы, позволяют обойти этическую проблему, поскольку они являются взрослыми соматическими клетками, которые были эффективно перепрограммированы, чтобы действовать как эмбриональные стволовые клетки, в том смысле, что они могут развиваться в любую клетку или ткань в организме.Это похоже на научную фантастику — выращивать собственные ткани и органы и просто заменять стареющие или больные части, как вы могли бы это сделать на машине. Я все еще думаю, что им еще предстоит пройти долгий путь в разработке того, как превратить стволовые клетки в специализированные клетки, а также как успешно трансплантировать органы. Хотя, учитывая, что стволовые клетки будут поступать от человека, получившего трансплантат, вероятность отторжения меньше, но все же смогут ли они однажды пересадить мозг?

http: // beyouthful.ne — 6 мая 13 в 5:14

Спасибо! Это было очень полезно для моего научного проекта по генетике!

NOTPABLO — 2 мая 13 в 18:23

Мне нужно от 2 до 4 строк о плюрипотентных стволовых клетках, кроме определения

raj — 30 декабря 2012 в 16:51

Я смущен; Я просматриваю записи об умершем пациенте, которому была проведена трансплантация периферических стволовых клеток от неродственного донора, позже у него случился рецидив и было проведено лечение мезенхимальными стволовыми клетками.Клетки какого типа используются при первой трансплантации аллогенических стволовых клеток? Мультипотентность? У пациента был рецидив, и он был невосприимчив к многократному лечению до мезенхимального лечения. В конце концов, это тоже не помогло ему. Я пытаюсь понять процесс его болезни. Он был ОМЛ, М-2, которому предшествовал МДС. Молодому человеку тоже всего 49. Я работаю медсестрой-консультантом, и меня интересует трансплантология. Я пока еще многого не понимаю.

янв — 25 ноя 12 в 23:57

могут ли стволовые клетки вылечить бесплодие?

benjie — 7 сен-12 в 22:01

Я боролся с этическими вопросами об эмбриональных стволовых клетках.Мне также поставили диагноз болезнь Паркинсона с 2005 года. Скорость, с которой эта болезнь обгоняет мое 53-летнее тело, ужасает. Любые новые открытия, которые могли бы помочь победить это и другие хронические заболевания, пожалуйста, ПОЖАЛУЙСТА, ПОЖАЛУЙСТА, поторопитесь. Я, например, долго не протяну. Я буду обсуждать любые этические проблемы, которые могут у вас возникнуть, как только я выздоровею.

djvc — 29 декабря 11 в 3:26

Заголовок:

скучать РС Миссис г-н доктор Rev’d ПрофессорДругой

(не показан)

Подтвердить:

,

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *