Недорогой женский возбудитель: Возбуждающие средства купить в интернет-магазине OZON

Реферат

Предпосылки

Существует острая потребность в быстрой, чувствительной и доступной диагностике микробных инфекций в местах оказания медицинской помощи. Хотя сообщалось о ряде инновационных систем, которые превращают мобильные телефоны в потенциальные диагностические инструменты, проблема перевода в клиническую диагностику остается серьезным препятствием, которое необходимо преодолеть.

Методы

Система изотермической изотермической амплификации в реальном времени на базе смартфона (smaRT-LAMP) была разработана для идентификации патогенов у пациентов с мочевым сепсисом.Бесплатное специально разработанное приложение для мобильного телефона позволяет телефону служить автономным устройством для количественной диагностики, позволяя определять количество копий генома бактериальных патогенов в режиме реального времени.

Результаты

Непосредственный сравнительный бактериальный анализ мочи пациентов с сепсисом показал, что эффективность smaRT-LAMP сравнялась с клинической диагностикой в ​​госпитале за долю времени (~ 1 час против 18–20 минут). 28ч). Среди пациентов с бактериемическими осложнениями мочевого сепсиса идентификация патогена в моче соответствовала таковой в крови, что потенциально позволяло диагностировать патоген вскоре после госпитализации.Кроме того, smaRT-LAMP не давал ложноположительных результатов у пациентов с сепсисом с клинически отрицательными культурами мочи.

Интерпретация

Система smaRT-LAMP эффективна против различных грамотрицательных и положительных патогенов и биологических образцов, ее изготовление стоит менее 100 долларов США (в дополнение к смартфону), и ее можно настроить для одновременного обнаружения нескольких патогенов. . Таким образом, SmaRT-LAMP предлагает возможность быстрой диагностики и лечения инфекций мочевыводящих путей и сепсиса мочевыводящих путей с помощью простого теста, который можно провести с небольшими затратами в месте оказания медицинской помощи.

Фонд

Национальные институты здравоохранения, Биохаб Чана-Цукерберга, Фонд Билла и Мелинды Гейтс.

Ключевые слова

Диагностика патогенов с помощью смартфона

Мочевой сепсис

Инфекция мочевыводящих путей

Диагностический тест мочи

Рекомендуемые статьиЦитирующие статьи (0)

© 2018 Авторы. Опубликовано Elsevier B.V.

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Антилейшманиальные эффекты, направляемые патогенами и хозяевами, опосредованные полигексанидом (PHMB)

Абстрактные

Фон

Кожный лейшманиоз (КЛ) — это забытое тропическое заболевание, вызываемое простейшими паразитами рода Leishmania .CL причиняет огромные страдания во многих странах мира. Лицензированной вакцины против CL не существует, а варианты химиотерапии демонстрируют ограниченную эффективность и высокую токсичность. Локализация паразитов внутри клеток-хозяев является препятствием для большинства стандартных химио- и иммунных вмешательств. Следовательно, отчаянно необходимы новые лекарства, которые являются безопасными, эффективными и легкодоступными для стран третьего мира, и / или технологии доставки лекарств для эффективного лечения ХЛ.

Методология / основные выводы

Здесь мы оценили антилейшманиальные свойства и потенциал доставки полигексаметилен бигуанида (PHMB; полигексанид), широко используемого антимикробного и раневого антисептика, в модели Leishmania .PHMB показал присущую антилейшманиозную активность при субмикромолярных концентрациях. Наши данные показали, что PHMB убивает Leishmania major ( L . major) через по двойному механизму, включающему нарушение целостности мембраны и селективную конденсацию и повреждение хромосом. Свойства связывания ДНК PHMB и входа в клетку-хозяина дополнительно использовали для улучшения доставки и иммуномодулирующей активности неметилированных цитозин-фосфат-гуаниновых олигодезоксинуклеотидов (CpG ODN).PHMB спонтанно связывает CpG ODN, образуя стабильные нанополиплексы, которые усиливают поглощение CpG ODN, усиливают антимикробное уничтожение и снижают токсичность PHMB для клеток-хозяев.

Выводы

Учитывая его низкую стоимость и долгую историю безопасного местного применения, PHMB является многообещающим лекарством для терапии ХЛ и средством доставки иммуномодуляторов нуклеиновых кислот.

Сведения об авторе

Внутриклеточные патогены трудно убить, поскольку их локализация внутри клеток-хозяев обеспечивает защиту от иммунитета и химиотерапии.Таким образом, для успешного лечения заболеваний, вызванных внутриклеточными патогенами, может потребоваться комбинированная терапия и эффективные системы доставки. Кожный лейшманиоз (КЛ) вызывается внутриклеточными простейшими патогенами рода Leishmania . ХЛ — давно сложившаяся глобальная проблема, однако подходящих вариантов вакцины или химиотерапии не существует. Мы обнаружили, что хорошо переносимый катионный полимер PHMB способен непосредственно уничтожать Leishmania major ( L . major) и усиливать управляемое хозяином уничтожение путем улучшения доставки иммуномодулирующих нуклеиновых кислот.Исследование демонстрирует параллельное уничтожение внутриклеточного патогена, направленное на хозяина и патоген, в присутствии эффективных платформ доставки лекарств. Эта общая стратегия имеет большие перспективы для лечения ряда заболеваний, вызываемых внутриклеточными патогенами.

Образец цитирования: Фирдесса Р., Гуд Л., Амстальден М.С., Чиндера К., Камаруцзаман Н.Ф., Шультейс М. и др. (2015) Антилейшманиальные эффекты, управляемые патогенами и хозяином, опосредованные полигексанидом (PHMB). PLoS Negl Trop Dis 9 (10): e0004041.https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004041

Редактор: Мэри Энн Макдауэлл, Университет Нотр-Дам, США

Поступила: 14 апреля 2015 г .; Принята к печати: 6 августа 2015 г .; Опубликовано: 2 октября 2015 г.

Авторские права: © 2015 Firdessa et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в пределах документ и вспомогательные информационные файлы к нему.

Финансирование: РФ было поддержано стипендиями German Excellence Initiative для Высшей школы естественных наук и DAAD STIBET Abschlussbeihilfe, Вюрцбургский университет, Германия. MCA поддерживается программой «Наука без границ», Фондом CAPES, Министерством образования Бразилии, Бразилиа. Мы благодарны за поддержку SFB 630 Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: РФ, LG и HM имеют или подали заявки на патенты по этой теме. Все остальные авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует. Это не влияет на нашу приверженность политике PLOS по обмену данными и материалами.

Введение

Лейшманиоз существовал веками как опасное для жизни и обезображивающее заболевание, эндемичное в 98 странах по всему миру, с общей оценочной распространенностью 12 миллионов и ежегодной заболеваемостью 2 миллионами новых случаев [1,2].В основном это затрагивает беднейшие регионы мира, где пациенты не могут позволить себе лекарства. Он также эндемичен в нескольких развитых странах, включая Францию ​​и Испанию, и есть сообщения о росте случаев лейшманиоза в развитых странах, где болезнь считается неэндемичной [3,4]. Лейшманиоз классически подразделяется на три основные клинические формы: кожную, кожно-слизистую и висцеральную. Две трети всех случаев во всем мире представляют собой проявления кожного лейшманиоза (КЛ) [2,5,6].Симптомы ХЛ варьируются от единичных самозаживающих кожных ран до стойкого метастатического заболевания [7]. Основа для таких разнообразных патологий является многофакторной и сложной, а функционирование врожденной иммунной системы и ее рецепторы распознавания образов являются определяющими факторами [7,8]. Таким образом, иммунитет хозяина является решающим фактором, влияющим на исход инфекции Leishmania . Кроме того, паразиты Leishmania манипулируют и подрывают иммунные ответы хозяина. Например, L . основная инфекция сдвигает клеточный иммунитет, связанный с цитокинами, такими как интерлейкин (IL) -12, интерферон гамма (IFN-γ) и фактор некроза опухоли (TNF) -α, продуцирующий Th2 CD4 ⁺ T-лимфоцитов, на гуморальный иммунитет, связанный с с (Th3) CD4 ⁺ ответы Т-лимфоцитов у восприимчивых хозяев [9–11]. Напротив, отклонение иммунной системы хозяина в сторону Th2 приводит к эффективному удалению паразита от хозяина и является многообещающим подходом для внутриклеточной терапии патогенов.

CL — это тропическая болезнь, которой не уделяют должного внимания, и медицина не обеспечивает подходящей терапии. Доступные методы лечения устарели, и системные побочные эффекты часто перевешивают любые клинические преимущества [12,13]. После десятилетий исследований в области разработки лекарств до сих пор нет нового коммерческого препарата для лечения ХЛ. Большинство пациентов в пострадавших регионах бедны и не могут позволить себе лекарства, что препятствует инвестициям в фармацевтическую промышленность. Большой интерес представляют альтернативные подходы к лечению, которые являются безопасными, эффективными и легко доступными для стран третьего мира.Среди нескольких стратегий открытия лекарств репозиционирование существующих лекарств от других областей болезней считается рентабельной стратегией и учитывает многие используемые в настоящее время противопаразитарные препараты, и, таким образом, исторически играло важную роль в разработке антипаразитарных лекарств [ 14]. Например, амфотерицин B, милтефозин и паромомицин были изменены для лечения лейшманиозов.

Текущие схемы лечения CL могут быть как местными, так и системными. Выбор системной или местной терапии основан на подвидах Leishmania , географических регионах, тяжести заболевания и иммунном статусе пациента [15,16].Сложные случаи, такие как пациенты с более чем тремя поражениями, единичное поражение размером> 40 мм в диаметре, поражение в косметически и функционально деликатных частях тела (таких как лицо, суставы, кожно-слизистые зоны, лимфатические узлы) и пациенты с ослабленным иммунитетом, должны лечиться системно [16 ]. Парентеральное введение сурьмы, пентамидина, амфотерицина В или милтефозина перорально является стандартным системным лечением ХЛ. Однако их эффективность ограничена несколькими факторами, включая значительную токсичность и другие побочные эффекты [2,3,15,17].Местное лечение, такое как мазь с паромомицином и инфильтрация сурьмой, рекомендовано Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) в качестве лечения первой линии для неосложненных случаев ХЛ [2]. Хотя местные методы лечения имеют значительные преимущества перед системной терапией, они еще не показали сильного и стойкого эффекта. В целом, доказательств потенциальной пользы текущих методов лечения ХЛ недостаточно. Недостаточное уничтожение скрытых паразитов внутри макрофагов и недостаточная концентрация лекарства в дерме являются факторами, которые, по-видимому, препятствуют его клиническому применению [18,19], что указывает на необходимость улучшенных стратегий доставки, абсорбции и удержания лекарств.Важно отметить, что было показано, что липосомы, нагруженные лекарствами, усиливают проникновение in vitro лекарства через обнаженную кожу и улучшают антилейшманиальную активность in vivo у экспериментально инфицированных мышей [12,20,21]. Кроме того, модуляция иммунной микросреды для лечения ХЛ, направленного на хозяина, была предложена в качестве потенциальной терапевтической и профилактической стратегии [22]. Действительно, иммуномодуляция в ответ на Th2-ответы с использованием иммуномодулирующих агентов, таких как CpG ODN, показала многообещающую эффективность против лейшманиоза [23-25].Еще одно преимущество состоит в том, что CpG ODN может ускорять заживление ран [26,27]. Аналогичным образом было показано, что местное применение иммуномодулятора имиквимода способствует заживлению ран при ХЛ [21,28]. Следовательно, улучшенная композиция CpG ODN может стабилизировать олигомеры против деградации, усилить поглощение клетками, увеличить гибель внутри макрофагов и способствовать заживлению ран.

PHMB — синтетический катионный полимер, рекомендованный в качестве лечения первого выбора для локально инфицированных и критически колонизированных ран [29].PHMB обладает антимикробным действием и используется для лечения некоторых паразитарных инфекций, но нет сообщений о его применении против внутриклеточных патогенов или видов Leishmania . Помимо прямого противомикробного действия, PHMB может опосредовать доставку других терапевтических средств. Несколько синтетических и природных катионных полимеров используются в качестве носителей нуклеиновых кислот, образуя полиплексные (любой комплекс полимера и нуклеиновых кислот) наноструктуры за счет их способности конденсировать нуклеиновые кислоты в частицы, позволяя при этом диссоциацию внутри клетки [30,31].Следовательно, PHMB имеет потенциал двойного применения против инфекций, обеспечивая как прямое уничтожение патогенов, так и усиленную доставку нуклеиновых кислот, которые могут модифицировать иммунную систему для усиления уничтожения.

Здесь мы стремились исследовать потенциальное использование PHMB в качестве антилейшманиального агента и в качестве невирусного носителя нуклеиновых кислот CpG ODN. Мы обнаружили, что сам по себе PHMB обладает мощной лейшманицидной активностью при субмикромолярных концентрациях. Лейшманицидные механизмы действия PHMB, по-видимому, включают нарушение клеточных мембран паразитов, проникновение в клетки и конденсацию / разрушение хромосом паразитов.Кроме того, мы обнаружили, что PHMB спонтанно связывает CpG ODN и образует стабильные нанополиплексы, взаимодействуя с CpG ODN при соответствующих дозировках. PHMB также защищает и стимулирует клеточное поглощение CpG ODN. Интересно, что нанополиплексы эффективно противодействуют токсичности, связанной с PHMB, взаимодействуя с отрицательно заряженными CpG ODN посредством образования комплекса / экранирования заряда. Следовательно, PHMB / CpG ODN может обеспечивать комбинированный лейшманицидный эффект, направленный на хозяина и патогена, против CL и может обеспечивать множество преимуществ для терапии CL.

Методы

Культура клеток

BMDM были получены из костного мозга мышей BALB / c (Charles River Breeding Laboratories, Зульцфельд, Германия) и культивированы в течение 6 дней при 37 ° C и 5% CO ₂ , как недавно описано [32]. Затем первичный BMDM собирали и поддерживали в полной безфенольной среде Roswell Park Memorial Institute (RPMI), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (инактивированной нагреванием при 56 ° C в течение 30 минут), 2 мМ L-глутамина, 10 мМ буфера HEPES. , 0,05 мМ раствор β-меркаптоэтанола, гентамицин (50 мкг / мл) и пенициллин G (100 ед / мл) для всех экспериментов.Такие же среды использовались в L . основных экспериментов с паразитами . Эпителиальные клетки почек 293T (DSMZ-No ACC-635, Брауншвейг, Германия) культивировали и поддерживали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (4,5 г / л) без L-глутамина и фенолового красного, но содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (инактивированной нагреванием). 200 мМ L-глутамин и пируват натрия. Кальциевая температура взрослого человека (HaCaT, кератиноциты) была получена от доктора Амира Шарили, Лондонский университет королевы Марии. Кератиноциты культивировали в среде DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, с 4.5 г глюкозы / л, 0,11 г пирувата натрия / л и 0,584 г / л L-глутамина.

Анализ AlamarBlue

Цитотоксичность различных соединений или составов против клеток млекопитающих (BMDM или эпителиальные клетки 293T) и L . основных промастиготов определяли, как описано ранее [33]. Вкратце, 4 × 10 ⁴ клеток млекопитающих или 10 × 10 ⁶ вирулентных L . основных промастигот (штамм MHOM / IL / 81 / FE / BNI) в логарифмической фазе роста добавляли в каждую лунку 96-луночных планшетов и культивировали с пятью возрастающими концентрациями каждого соединения при 37 ° C или 27 ° C в течение 24 ч соответственно.Стандартные антилейшманиальные препараты, включая амфотерицин B (A2942), пентамидин изотионат (P0547) и сульфат паромомицина (P9297) от Sigma-Aldrich (Дайзенхофен, Германия) и милтефозин (1-гексадецилфосфорилхолин) (Cayman Chemical Company, США). используется в качестве положительного контроля. Краситель AlamarBlue (Trinova Biochem GmbH, Гиссен, Германия) добавляли в каждую лунку в концентрации 10% и инкубировали еще 48 часов. Затем измеряли оптическую плотность (OD) с помощью ридера Multiskan Ascent ELISA при длине волны 550 нм и 630 нм.Значение OD или% уменьшения красителя пропорционально количеству жизнеспособных клеток / паразитов и использовалось для расчета IC ₅₀ на основе теоремы о перехвате.

Репортерный анализ люциферазы (анализ амастигот)

Анализ основан на измерении биолюминесценции люциферазы светлячков, которая катализирует образование света из АТФ и люциферина. Вирулентная трансгенная люцифераза (Luc-tg) L . Штамм major , содержащий репортерный ген люциферазы светлячков, поддерживался непрерывным пассацией на самках мышей BALB / c и выращивался в 96-луночных культурах кровяного агара при 27 ° C, 5% CO ₂ и влажности 95%.Трансгенная люцифераза L . мажорный штамм использовался для инфицирования BMDM в соответствии с недавно разработанным протоколом [34]. Вкратце, числа BMDM доводили до 2 × 10 ⁵ , культивировали в 96-луночных планшетах и ​​инкубировали в течение 4 часов, чтобы обеспечить прилипание к поверхности. Число промастигот доводили до 3 × 10 ⁶ паразитов на мл для достижения скорости инфицирования 1:15. Затем осуществляли инфицирование, отбрасывая супернатант культивируемых клеток и заменяя его равным объемом полной среды RPMI, содержащей суспензию промастигот.После инкубации инфицированного BMDM (37 ° C, 5% CO ₂ ) в течение 24 часов для полной дифференциации промастигот в амастиготы среду, содержащую внеклеточных паразитов, удаляли, а лунки трижды промывали той же средой RPMI. . Пять серийных разведений каждого вещества (1: 5) в той же свежей среде RPMI добавляли к инфицированному BMDM в двух экземплярах с соответствующими контролями. После дополнительных 24 часов инкубации при 37 ° C и 5% CO _2, инфицированный BMDM лизировали люциферин-содержащим буфером (Britelite, PerkinElmer, Германия) и измеряли люминесценцию с помощью считывающего устройства для люминесцентных планшетов Victor X Light 2030. люминометр (PerkinElmer).Значения IC ₅₀ соединений против внутриклеточных амастигот были рассчитаны на основе теоремы перехвата, как описано ранее [34,35].

Проточная цитометрия

красителей PI и YO-PRO-1 (Life Technologies, Дармштадт, Германия) промастиготами измеряли с помощью MACS Quant Analyzer (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Германия) и использовали для определения целостности мембраны [36]. Краситель YO-PRO-1 избирательно проходит через плазматические мембраны апоптотических клеток, но не маркирует живые клетки [36]. Л. . основных промастиготов обрабатывали 2 мкМ PHMB в указанные моменты времени, а затем промывали при 3000 × g в течение 10 мин. Образцы окрашивали путем инкубации с красителями PI или YO-PRO-1 в течение 15 минут в темноте при комнатной температуре в соответствии с инструкциями производителя. Затем образцы были промыты, и с помощью проточной цитометрии было немедленно зарегистрировано в общей сложности 100 000 событий. Точно так же адгезивным клеткам BMDM позволяли поглощать флуоресцентный PHMB (конъюгат PHMB-FITC) в присутствии или в отсутствие пяти различных фармакологических ингибиторов (цитохалазин D (C8273, используемый в дозе 5 мкг / мл), вортманнин (W1628, используемый в 12). .85 мкг / мл), хлорпромазина гидрохлорид (C8138, используется в концентрации 10 мкг / мл), икаругамицин (SML0188, используется в концентрации 1 мкМ) и dynasore (D7693, используется в концентрации 25,8 мкг / мл), Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Германия). PHMB (Polyhexamethylene biguanide; CAS # 27083-27-8; альтернативные химические названия: полигексанид, полиаминопропилбигуанид, M _w = 2780 г / моль) [37] был предоставлен лабораторией доктора Лиама Гуда и Tecrea Ltd, Лондон, Великобритания (www.tecrea.co.uk), при исходных концентрациях 1 мг / мл и 200 мг / мл. PHMB представляет собой катионную и амфипатическую структуру, состоящую из повторяющихся основных звеньев бигуанидина, соединенных гексаметиленовыми углеводородными цепями.Структура и концентрации PHMB в процентах по весу / объему показаны в дополнительной информации (рис. S1 и таблица S1). PHMB (PHMB-FITC) был произведен в соответствии с недавно разработанным методом (более подробная информация будет предоставлена ​​в отдельной публикации, представленной Chindera et al.). Вкратце: 2 мг флуоресцеинизотиоцианата (FITC) растворяли в диметилформамиде, который содержит 50 мкл N, N-диизопропилэтиламина. Затем раствор смешивали с 50 мг PHMB в объеме 200 мкл и встряхивали в течение ночи при комнатной температуре.Полученную смесь диализовали с использованием мембраны с отсечкой по молекулярной массе 3,5 кДа против 50% водного этанола в течение 5 дней с периодической сменой диализата и лиофилизировали для получения флуоресцеинил-PHMB (PHMB-FITC). Кроме того, были получены полиплексы между PHMB и 3′-концом CpG ODN, меченным родаминовым красным (CpG-R) (M _w = 6891 г / моль, последовательность TCCATGACGTTCCTGATGCT, Eurofins MWG Operon, Германия) в соотношении 1: 1 (w / w ) соотношение для изучения поглощения. Поилплексы и CpG-R инкубировали с BMDM в отсутствие или в присутствии ингибиторов эндоцитоза в различные моменты времени.BMDM собирали, промывали, разбавляли до 1 × 10 ⁶ , и с помощью проточной цитометрии регистрировали в общей сложности 20000 событий на образец. Данные анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (Tree Star Inc., Калифорния, США).

Флуоресцентная микроскопия и конфокальная микроскопия

BMDM или промастиготы культивировали совместно с указанными дозами флуоресцентного PHMB в течение 24 или 48 часов. Образцы переносили в пробирки объемом 15 мл, промывали и фиксировали 4% параформальдегидом. ДНК L . основных промастиготов и BMDM контрастировали с помощью Hoechst 33342 (Life Technologies, h4570, Дармштадт, Германия). Наконец, 10 мкл раствора, содержащего паразитов или BMDM, добавляли к предметным стеклам и закрывали покровными стеклами для микроскопических исследований. Изображения получали с использованием систем флуоресценции живого видео и конфокальной микроскопии (Wetzlar, Германия).

Анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA)

Геномная ДНК была выделена из 1,5 × 10 ⁹ L . основных промастигот с использованием набора геномной ДНК Purelink (K1820-01, Life Technologies, Германия) и количественно определено с помощью спектрофотометра NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Германия ) . Составы полиплекса PHMB / гДНК получали добавлением и смешиванием 4,5 мкг гДНК с PHMB (0–54 мкг) в конечном объеме 30 мкл воды. Точно так же полиплексы PHMB / CPG ODN или PHMB / CpG-R получали смешиванием 30 мкг CpG ODN 1668 (M _w = 6058 г / моль, последовательность TCCATGACGTTCCTGATGCT, Eurofins MWG Operon, Германия) или 15 мкг CpG-R с PHMB (0–54 мкг) в конечном объеме 30 мкл воды соответственно.После тщательного перемешивания пипеткой полиплексы оставляли при комнатной температуре на 2 ч перед анализом. Затем образцы объединяли с загрузочным красителем 6 × синий / оранжевый (Promega, Германия) и наносили на 1% агарозный гель, содержащий краситель геля нуклеиновой кислоты SYBR gold (S11494, Life Technologies, Германия) для электрофореза.

Просвечивающая электронная микроскопия

Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) была использована для определения размеров частиц и характеристики стабильности и морфологии полиплексов PHMB / CPG ODN.Для тестирования стабильности полиплексы получали смешиванием PHMB и CpG ODN в соотношении 2: 1 (мас. / Мас.) И выдерживали при 4 ° C в течение двух месяцев. Затем образцы помещали на сетку размером 300 меш, окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца, анализировали с помощью ПЭМ (JEOL JEM-2100, Германия) при 80 кВ и 200 кВ с TVIPS F416 4k x 4k и Olympus Veleta 2k x 2k. системы и полученные при увеличении 4400 или 12000 x.

Динамическое рассеяние света (DLS) и электрофоретическое рассеяние света (ELS)

Размеры частиц и дзета-потенциал полиплексов PHMB / CpG ODN измеряли с использованием сошника Beckman Delsa Nano C (Beckman Coulter, Крефельд, Германия).Режим анализа CONTIN и уравнение Смолуховского использовались для определения размера и дзета-потенциала, соответственно. Измерения проводили в трех экземплярах и воспроизводили не менее двух раз. Измерения размера и дзета-потенциала проводили в чистых одноразовых кюветах, содержащих 500 мкл воды Millipore или воды с отрегулированной ионной силой (ISA) (KCl 0,15M) и полиплексов PHMB / CpG ODN в соотношении 2: 1 или 1: 1 (w / ш). Распределение среднего размера частиц полиплексов с их индексом полидисперсности (PDI) и значениями дзета-потенциала определяли с помощью DLS и ELS.Все измерения проводились при 25 ° C. Рассеянный свет детектировали под углом 165 ° (размер частиц) и 15 ° (дзета-потенциал).

Изотермическая калориметрия титрования (ITC)

Сродство и специфичность взаимодействий между PHMB и CpG ODN изучали путем прямого измерения тепла, выделяемого или поглощаемого во время событий связывания, с помощью системы MicroCal iTC200 (GE Healthcare Northampton, MA, США). Все образцы были разбавлены водой Millipore и дегазированы ультразвуком в течение 15 мин перед их использованием.Микрошприц на 40 мкл заполняли 0,3 мМ PHMB и вводили со скоростью 2 мкл / инъекцию в образцы клеток, содержащие 200 мкл 0,03 мМ CpG ODN, всего для 20 отдельных инъекций. Шприц для титранта действует как мешалка со скоростью 400 об / мин. Задержка стабилизации теплового сигнала перед первым впрыском составила 3 ​​мин. Интервал впрыска составлял 150 секунд, и использовалась калибровочная мощность 5 ± 0,5 мккал / сек. Измерения проводили трижды при 25 ° C. Фоновое тепло определяли путем титрования воды Millipore в CpG ODN и вычитали из основного эксперимента.Все данные были автоматически собраны и проанализированы с использованием программного обеспечения Origin и SigmaPlot для определения термодинамических параметров. Изотерма связывания ( ΔH ) была использована для подгонки к соответствующей модели.

Определение продукции цитокинов

BMDM были получены из самок мышей BALB / c, как описано выше в культуре клеток. 1 × 10 ⁶ BMDM высевали в конечном объеме 0,5 мл в 24-луночные планшеты, инфицированные L . основных промастиготов при соотношении паразитов и BMDM 15: 1, промывали и инкубировали при 37 ° C в течение 30 мин в полной среде RPMI, содержащей CpG ODN (15 мкг / мл).Полиплексы PHMB, CpG ODN или PHMB / CpG ODN добавляли к предварительно активированным или контрольным клеткам и дополнительно инкубировали в течение 48 часов. Супернатанты собирали, и концентрации IL-6, IL-10, IL-4 или TNF-α (Biosciences, Висбаден, Германия) измеряли с помощью сэндвич-ELISA, в то время как IL-12p70 измеряли с использованием IL-12p70 ELISA Ready-SET- Используйте комплект от eBioscience в соответствии с инструкциями поставщиков.

Статистический анализ

Нормализация и процентные расчеты основывались на средней интенсивности флуоресценции (MFI) обработанных клеток по сравнению с контролем при анализе данных проточной цитометрии.Значения даны как среднее ± стандартная ошибка (SE). Статистическую значимость определяли с помощью t-критерия для одного образца (программное обеспечение Microsoft Excel).

Заявление об этике

Все мыши, использованные в этом эксперименте, содержались в определенных условиях, свободных от патогенов, и с ними обращались в строгом соответствии с Законом Германии о защите животных 2006 г. (TierSchG). Протокол на животных был одобрен правительством Нижней Франконии, Германия с номером разрешения: 55.2 –2531.01-26 / 12.

Результаты

Антилейшманиальные эффекты PHMB и предполагаемые механизмы его действия

Для исследования возможности использования PHMB в качестве местного терапевтического средства против CL, его антилейшманиальной активности против внеклеточной формы L . major (промастиготы) оценивали с помощью анализа жизнеспособности клеток AlamarBlue [33]. PHMB эффективно убивал промастиготы при субмикромолярных концентрациях дозозависимым образом (S2, фиг.). Определение 50% ингибирующих концентраций (значения IC ₅₀ ) подтвердило активность PHMB (IC ₅₀ = 0,41 мкМ) против L . основных промастигот in vitro с более высокой эффективностью, чем стандартные антилейшманиальные препараты, применяемые в настоящее время в клиниках (таблица 1).Было обнаружено, что PHMB в 39 раз более эффективен, чем пентамидин, в 69 раз более эффективен, чем милтефозин, и в 1000 раз более эффективен, чем паромомицин, который в настоящее время рекомендуется для лечения CL. Визуальные исследования с помощью световой микроскопии и ПЭМ четко выявили морфологические и поведенческие изменения промастигот после лечения PHMB (рис. 1). Кроме того, мы исследовали биологическую активность PHMB против внутриклеточной формы паразита (амастиготы) на модели макрофагов, инфицированных Leishmania- .Значение IC ₅₀ PHMB против внутриклеточных амастигот составляло 4 мкМ, что позволяет предположить, что эффективность PHMB ниже против амастигот по сравнению с промастиготами.

Рис. 1. Воздействие PHMB на L . major морфология и поведение.

(б и г) ПЭМ-изображения L . основных промастиготов (справа) с морфологическими изменениями, такими как усадка, обширная вакуолизация цитоплазмы (V), заметная потеря цитозольного содержимого и конденсированное ядро ​​(N).Изображения b и d были получены после обработки 2 мкМ PHMB в течение 48 и 24 часов соответственно. (a и c) Необработанные контроли (слева) демонстрируют нормальную удлиненную морфологию промастигот с интактным и четким отличным кинетопластом (кДНК), N, митохондрией (M), липидными вакуолями (LV) и гликозомой (G). (e-h) Изображения световой микроскопии, показывающие морфологические и поведенческие изменения (отсутствие образования зажимов, как указано стрелками) после обработки 2 мкМ PHMB в течение 24 часов. Масштабные линейки = (а) 1,1 мкм, (б) 0,6 мкм, (в и г) 0.25 мкм, (e и f) 7,5 мкм и (g и h) 25 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004041.g001

Таблица 1. Антилейшманиальные и цитотоксические эффекты полиплексов PHMB и PHMB / ДНК.

Таблицы показывают антилейшманиальную эффективность, цитотоксичность и селективность соединений. Показаны значения IC ₅₀ и / или индекс селективности (SI) соединений по сравнению со стандартными антилейшманиозными лекарственными средствами. Табличные значения представляют собой средние значения IC ₅₀ из 3–6 независимых экспериментов для каждого соединения.IC ₅₀ = минимальная концентрация веществ, необходимая для уничтожения 50% населения; SI = среднее IC ₅₀ против BMDM / среднее IC ₅₀ против L . основных амастигот; ND = не определено.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004041.t001

Чтобы определить уровень избирательности PHMB в отношении патогена / хозяина, мы измерили его цитотоксичность в отношении первичных макрофагов костного мозга (BMDM), кератиноцитов и эпителиального эпителия 293T. клеток с помощью анализа AlamarBlue.Полученные значения IC ₅₀ показывают, что PHMB примерно в 6,5 раз более токсичен в отношении BMDM (IC ₅₀ = 4 мкМ), чем эпителиальные клетки 293T (IC ₅₀ = 26 мкМ). Более того, PHMB убил 50% кератиноцитов в концентрации 6,6 ± 3,5 мкМ. Результаты показывают, что кератиноциты более чувствительны к PHMB по сравнению с эпителиальными клетками 293T, но менее чувствительны, чем BMDM. Хотя PHMB в настоящее время безопасно используется для нескольких целей в клиниках и на производстве, наши результаты показали, что PHMB имеет плохую селективность между амастиготами и BMDM с индексом селективности 1 (таблица 1).Конечно, важно учитывать, что эти значения относятся к клеткам, выращенным в культуре.

Ободрен эффективностью PHMB против L . основных промастигот, мы исследовали лежащие в основе его механизмы действия. Литературные исследования показали, что микробная избирательная токсичность PHMB обусловлена ​​преимущественным разрушением микробных мембран по сравнению с мембранами млекопитающих [38,39]; считается, что он специфически взаимодействует с кислыми фосфолипидами микробных патогенов, в то время как нейтральные фосфолипиды в мембранах клеток млекопитающих затрагиваются лишь незначительно [38,40].Мы предположили, что PHMB также убивает L . основных паразитов с помощью этого механизма и протестировали влияние PHMB на целостность мембран промастигот с использованием пропидия йодида (PI), красителя, который может проникать в паразита и окрашивать ДНК только после потери целостности мембраны. После инкубации промастиготов с 2 мкМ PHMB в течение 30 минут более 20% популяции паразитов было окрашено PI, и окрашивание увеличивалось в более поздние моменты времени (рис. 2A). Мы повторили анализ исключения красителя с использованием красителя YO-PRO-1 в соответствии с инструкциями производителя, и результаты показали аналогичную зависящую от времени проницаемость (рис. 2В).Следовательно, PHMB повреждает целостность мембран паразитов в зависимости от времени, и проницаемые паразиты наблюдались в течение 30 минут, что подтверждает гипотезу о том, что PHMB разрушает мембраны паразитов.

Рис. 2. Механизм (ы) действия PHMB на L . основных промастигот.

PHMB нарушил целостность мембраны и конденсировал ДНК в L . основных промастигот. Типичная гистограмма FACS (а) йодид пропидия (PI) и (b) окрашивание промастигот красителем YO-PRO-1 после обработки 2 мкМ PHMB в указанные моменты времени, демонстрируя зависящее от времени влияние PHMB на целостность мембраны.Убитые нагреванием промастиготы и амфотерицин B в концентрации 2 мкМ использовали в качестве положительного контроля. (c) Анализ с помощью флуоресцентной микроскопии, показывающий конденсированные и поврежденные материалы ДНК L . основных промастигот после обработки PHMB в концентрации 2 мкМ в течение 48 часов по сравнению с имитационным контролем (дистиллированная вода). Масштабные линейки = 5 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004041.g002

Во время анализа ультраструктуры с помощью ПЭМ мы постоянно наблюдали конденсацию ядер паразитов после инкубации с 2 мкМ PHMB в течение 24─48 часов (рис. 1).Более того, механизм бактерицидного действия PHMB был связан с его сильным и кооперативным взаимодействием с нуклеиновыми кислотами in vitro [41]. Это привело нас к мысли, что механизм (ы) уничтожения паразитов PHMB может также включать связывание с ДНК внутри паразитов. Чтобы проверить эту возможность, промастиготы обрабатывали 2 мкМ PHMB в течение 48 часов, окрашивали Hoechst 33342 и исследовали с помощью конфокальной и флуоресцентной микроскопии. Результаты показали, что PHMB связывает, конденсирует и разрушает структуры хромосом (рис. 2C).Эта интерпретация клеточных эффектов потребует проникновения полимера в паразитов, а также прочного связывания PHMB с геномной ДНК паразита (гДНК). Для проверки проникновения паразитов, L . основных промастиготов инкубировали с производным PHMB, ковалентно помеченным флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) в концентрации 0,35 мкМ (суб-IC ₅₀ ). Результаты подтверждают, что паразиты поглощают PHMB-FITC, и полимер распределяется по ядрам, где он может взаимодействовать с хромосомами (рис. 3A).Для проверки связывания хромосом мы использовали выделенную геномную ДНК (гДНК) из L . major и анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA). Четкое замедление миграции подтвердило, что PHMB и гДНК образуют полиплексы при относительном весовом соотношении ≥ 0,25 и, таким образом, могут также связывать хромосомную ДНК внутри паразитов (рис. 4A).

Рис. 3. Клеточная локализация PHMB-FITC в промастиготах и ​​BMDM.

Конфокальные изображения, показывающие поглощение PHMB-FITC (а) промастаготами и (б) BMDM.Обратите внимание на очевидное ядерное исключение в клетках BMDM, но не у паразитов, масштабная линейка = 10 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004041.g003

Рис. 4. Взаимодействие PHMB / ДНК и физико-химическая характеристика полиплексов.

Образование полиплексов PHMB / ДНК подтверждено 1% -ным агарозным гелем, ПЭМ и изменением цвета. (a) Полиплексы PHMB / gDNA, (b) ТЕМ-изображение, показывающее образование полиплексов PHMB / CpG ODN при соотношении 2: 1, (c) полиплексы PHMB / CpG ODN, (d) временное изменение мутности во время комплексообразования PHMB / CpG ODN, (e ) Полиплексы PHMB / CpG-R и (f) тот же гель (e) с измерением флуоресценции CpG-R.За исключением отрицательного контроля и одного только PHMB, все лунки содержали равные количества (вес) ДНК с различными концентрациями PHMB. М представляет собой 2-логарифмическую лестницу ДНК (0,1-10,0 т.п.н., New England Biolabs), а N представляет воду, используемую в качестве отрицательного контроля. Все указанные отношения PHMB / ДНК даны в относительной массе (мас. / Мас.). Указывает на полиплексы PHMB / CpG ODN двухмесячной давности. Масштабная линейка = 300 нм.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004041.g004

Далее мы рассмотрели, как PHMB избирательно конденсирует или разрушает хромосомы паразитов, не затрагивая ДНК хозяина.Чтобы исследовать клеточную локализацию (и) PHMB, мы использовали его флуоресцентную версию (PHMB-FITC). Клетки BMDM инкубировали с 1 мкМ PHMB-FITC, контрастировали с помощью Hoechst 33342 и исследовали интернализацию с использованием флуоресцентной и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Данные показывают, что PHMB легко проникает в BMDM, но локализуется в цитоплазме без видимого входа в ядра в клетках млекопитающих, указывая на неспособность проходить через ядерную оболочку (Рис. 3B). Следовательно, внутриклеточная локализация PHMB, по-видимому, отличается у BMDM и паразитов, и PHMB получает доступ к хромосомам паразита, но не к хромосомам макрофагов хозяина.

PHMB представляет собой новый невирусный носитель олигонуклеотидов CpG

Два основных наблюдения побудили нас предположить, что PHMB в комбинации с иммуномодулирующими нуклеиновыми кислотами может использоваться в качестве параллельного уничтожения внутриклеточного L , направляемого хозяином и патогеном. майор . Изначально мы знали, что он связывает геномную ДНК L . основных паразитов, образующих комплексы PHMB / гДНК. Более того, PHMB использовался в качестве носителя трансфекции siRNA в гибридной форме с оксидом железа [42].Чтобы проверить, можно ли улучшить доставку нуклеиновой кислоты с помощью PHMB, CpG ODN был выбран в качестве модели иммуномодулирующей молекулы нуклеиновой кислоты. CpG ODN — мощный иммуномодулятор, который активирует макрофаги и дендритные клетки, чтобы убить внутриклеточный L . основных паразитов [43]. Мы пришли к выводу, что комбинации PHMB и CpG ODN могут потенциально убивать паразитов напрямую через паразитарные мембраны и нарушение хромосом и косвенно через модуляцию иммунитета хозяина. В случае успеха такие двойные эффекты, направленные на хозяина и патогены, могут улучшить потенцию.В этом контексте был приготовлен и охарактеризован ряд составов полиплексов PHMB / CpG ODN, их биоактивность была оценена и сравнена со свободными компонентами.

Прежде чем оценивать потенциальное использование PHMB в качестве безопасного и эффективного носителя для нуклеиновых кислот, мы сначала хотели проверить, связывает ли PHMB CpG ODN с образованием стабильных нанокомплексов. Результаты ПЭМ показали, что существует комплексообразование между PHMB и CpG ODN при соотношении 2: 1 (фиг. 4B). Наши эксперименты с EMSA показали, что PHMB замедляет подвижность CpG ODN при относительных весовых соотношениях ≥ 0.25 (Рис. 4C). После добавления избытка PHMB к CpG ODN мы также наблюдали мгновенную реакцию, которая превращала бесцветный PHMB и CpG ODN в растворе во временный молочный вид, что свидетельствует об электростатических взаимодействиях между PHMB и CpG ODN и образовании комплекса (рис. 4D). В соответствии с образованием комплекса ODN в присутствии PHMB обнаруживал задержку миграции при анализе с помощью EMSA. Чтобы более четко визуализировать изменения подвижности олигонуклеотидов, тот же CpG ODN был помечен родаминовым красным на 3’-концах (CpG-R), и результаты подтвердили замедленную электрофоретическую подвижность и удержание CpG ODN в лунках (рис. 4E и 4F).

Затем мы охарактеризовали размер и поверхностный заряд комплексов с помощью DLS и ELS. Эти анализы выявили частицы с высокой воспроизводимостью размеров: 310,9 ± 30,5 нм и 285,3 ± 15,0 нм при относительных весовых соотношениях 2: 1 и 1: 1, соответственно (таблица 2). Значения PDI полиплексов были менее 0,3, что указывает на узкое распределение по размерам. Чтобы оценить стабильность полиплексов, их дзета-потенциал измеряли с помощью ELS и обнаружили, что он составляет + 33,3 ± 1,1 мВ (соотношение 2: 1) и –18,77 ± 0.4 мВ (соотношение 1: 1) и зависит от выбранного соотношения PHMB и CpG ODN (таблица 3). Как и ожидалось, более высокие отношения PHMB к CpG ODN приводили к полиплексам с более высокими положительными относительными дзета-потенциалами. Данные показывают, что комплексы PHMB / CpG ODN умеренно стабильны при соотношении 2: 1, тогда как они могут быть нестабильными при соотношении 1: 1. Для оценки стабильности с течением времени получали полиуплексы PHMB / CpG ODN и хранили при 4 ^° ° C в течение двух месяцев, прежде чем их физико-химическая природа была снова охарактеризована с помощью ТЕМ и EMSA.Были получены аналогичные результаты и, таким образом, подтверждена стабильность полиплексов с течением времени при соотношении 2: 1 (фиг. 4B и 4C обозначены знаком ®). Чтобы количественно оценить силу и специфичность взаимодействий между двумя молекулами, мы использовали изотермическую калориметрию титрования (ITC). Результаты показывают, что PHMB может сильно взаимодействовать с CpG ODN с образованием полиплексов, подтверждая его аффинность связывания с ДНК. Подробные термодинамические параметры указывают на последовательное связывание между PHMB и CpG ODN (рис. 5).Данные ITC показывают, что энтальпия реакции связывания PHMB / CpG ODN была изначально экзотермической (-18,37 ккал / моль), что указывает на сильное электростатическое взаимодействие между отрицательно заряженной фосфатной основной цепью CpG ODN и катионным заряженным полимером PHMB. Экзотермические сигналы уменьшались в ходе титрования и, как было обнаружено, выходили на плато при молярном соотношении 1: 1 обоих партнеров по связыванию. Наконец, результаты ПЭМ также подтверждают образование нанополиплексов между PHMB и CpG ODN и, кроме того, предполагают преимущественно сферическую морфологию полиплексов, а не цилиндрическую или стержневую форму (рис. 4B).Взятые вместе, результаты подтвердили, что существует сильное электростатическое взаимодействие между PHMB и CpG ODN, которое приводит к образованию умеренно стабильных полиплексных наночастиц.

Рис. 5. Физико-химические характеристики нанополиплексов PHMB / CpG ODN.

На рисунках показаны количественные измерения силы взаимодействия между CpG ODN и PHMB посредством ITC с соответствующими термодинамическими параметрами: сродство связывания ( K _a ), изменения энтальпии (Δ H ) и изменения энтропии (Δ S ).(a) Исходные данные, созданные ITC, (b) и (c) проанализировали данные ITC с использованием двух инструментов анализа данных и построения графиков: Origin и SigmaPlot, соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004041.g005

Таблица 2. Dynasore спасает убитых человек L . основных амастигот внутри макрофагов.

Dynasore ингибировал уничтожение внутриклеточного L . основных амастигот и промастигот полиплексами PHMB или PHMB / CpG ODN.Значения представляют собой среднее значение двух независимых экспериментов, и значения даны как среднее ± стандартная ошибка. Приведенные значения концентраций относятся к PHMB внутри полиплексов.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004041.t002

Таблица 3. Физико-химические характеристики нанополиплексов PHMB / CpG ODN.

В таблице показано определение размера частиц и дзета-потенциала с использованием DLS и ELS с их PDI. В таблице приведены результаты трех независимых экспериментов.Распределение по размерам и измерения дзета-потенциала проводили с использованием воды Millipore и воды ISA (0,15 М KCl), соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004041.t003

Затем мы проверили возможность использования PHMB в качестве безопасного и эффективного средства доставки для CpG ODN. Мы охарактеризовали полиплексы путем измерения эффективности захвата, цитотоксичности, антипаразитарной эффективности и их иммуномодулирующей активности по отношению к свободным компонентам. Эффективность захвата CpG-R в полиплексной форме была увеличена примерно в 15 раз по сравнению с свободной формой, в то время как поглощение PHMB в виде полиплекса не увеличилось, подтверждая, что PHMB может доставлять молекулы ДНК в макрофаги (рис. 6).Поскольку включение PHMB и CpG в конденсаты полиплексов может подавлять среднюю флуоресценцию PHMB-FITC или CpG-R, эти измерения поглощения могут недооценивать доставку. Чтобы узнать больше о механизме проникновения, мы исследовали их свойства поглощения макрофагами. Результаты конфокальной микроскопии и проточной цитометрии показали, что PHMB-FITC легко поглощается макрофагами в зависимости от времени (рис. 3B и 6A). Напротив, когда PHMB-FITC инкубировали с BMDM при 4 ° C в эквивалентных условиях культивирования клеток, поглощение было сильно снижено (87%) (рис. 7A), что указывает на то, что преобладающий механизм поглощения PHMB-FITC BMDM составляет через энергозависимый режим, который, вероятно, является эндоцитозом.Для идентификации специфических путей эндоцитоза использовался широкий спектр селективных ингибиторов эндоцитоза [32]. Вкратце: мы использовали: 1) вортманнин, мощный ингибитор фосфатидилинозитолкиназы (PI3K), который обычно используется в качестве ингибитора макропиноцитоза, 2) цитохалазин D, который блокирует полимеризацию актина и обычно используется в качестве ингибитора фагоцитоза, 3) диназорез. , ингибитор динамин-зависимого эндоцитоза, 4) хлорпромазина гидрохлорид, который ингибирует Rho GTPase, которая необходима для образования везикул, покрытых клатрином, при клатрин-зависимом эндоцитозе, и 5) икаругамицин, ингибитор ямочного эндоцитоза, покрытого клатрином .Клетки предварительно инкубировали со специфическими ингибиторами эндоцитоза в течение 30 минут перед воздействием PHMB-FITC, полиплексов, декстрана или трансферрина с последующей инкубацией при 4 ° C или 37 ° C в течение 4 часов. Результаты показывают, что только dynasore, проницаемая для клеток небольшая молекула, которая ингибирует активность динамин-GTPase, необходимую для динамин-зависимого эндоцитоза, эффективно ингибирует поглощение PHMB-FITC (ингибирование 80%) (фиг. 7A). Сходные результаты были получены для полиплексов PHMB-FITC / CpG ODN и PHMB / CpG-R (фиг. 7B и S3), предполагая, что пути поглощения PHMB BMDM не зависят от процессов образования полиплексов.Однако декстран и трансферрин эффективно ингибировались цитохалазином D и хлорпромазина гидрохлоридом, но не диназором. Взятые вместе, результаты показывают, что механизмы захвата PHMB-FITC и его полиплексов преимущественно связаны с через динамин-зависимый эндоцитоз.

Рис. 6. Поглощение клетками PHMB и CpG ODN и их полиплексов BMDM.

Наложенные гистограммы показывают зависящее от времени поглощение (а) полиплексов PHMB-FITC и (б) PHMB-FITC / CpG ODN макрофагами.Тогда как (c) показывает поглощение CpG-R BMDM в виде полиплексной формы по сравнению с его свободной формой. Гистограммы представляют три независимых эксперимента.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004041.g006

Рис. 7. Поглощение клетками полиплексов PHMB-FITC и PHMB-FITC / CpG ODN и эффекты селективных ингибиторов эндоцитоза.

Гистограммы показывают влияние различных ингибиторов и температуры на клеточное поглощение (a) PHMB-FITC, (b) полиплексов PHMB-FITC / CpG ODN, (c) декстрана / FITC, используемых в качестве положительного контроля, чтобы исключить влияние FITC, который может мешать клеточным механизмам поглощения PHMB и (d) алекса-448-меченного трансферрина, используемого в качестве положительного контроля для клатрин-зависимого эндоцитоза.Показаны нормализованные значения MFI трех независимых экспериментов по проточной цитометрии, и значения даны как среднее ± стандартная ошибка.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004041.g007

Затем мы оценили цитотоксичность в отношении клеток-хозяев. Неожиданно результаты показали, что значения IC ₅₀ полиплексов были намного выше (50 ± 10,4 4 мкМ и 33 ± 9,54 мкМ при соотношениях 1: 1 и 2: 1, соответственно) в отношении BMDM, чем для одного PHMB. Точно так же токсичность полиплексов PHMB / CpG ODN показала гораздо более высокие значения IC ₅₀ (185 ± 22.5 и 90,3 ± 23,5 при соотношении 1: 1 и 2: 1 соответственно) против эпителиальных клеток 293T, чем только PHMB. Результаты показывают, что полиплексы имеют резко сниженную токсичность в отношении клеток-хозяев по сравнению со свободным PHMB. Аналогичным образом мы проверили цитотоксичность полиплексов против L . основных промастигот , и результаты показывают более низкую эффективность по сравнению со свободным PHMB, а только CpG ODN не проявляет активности (Таблица 1). Катионная природа полимеров (более высокий положительный дзета-потенциал) часто связана с токсичностью по отношению к клеткам-хозяевам, и ожидается, что декатионизация снизит токсичность [44].Как и ожидалось, токсичность полиплексов против клеток BMDM и 293T возрастала по мере увеличения относительного массового отношения PHMB: CpG ODN (таблица 1). Эти результаты согласуются с нашими данными о дзета-потенциале, показывающими, что увеличение соотношений PHMB / CpG ODN увеличивает положительный заряд полиплекса (таблица 3).

Затем мы определили лейшманицидные эффекты PHMB и CpG ODN в полиплексной и свободной формах с использованием BMDM, инфицированного трансгенной люциферазой L . мажорный штамм .Полиплексы проявляли повышенную антилейшманиозную активность против внутриклеточных амастигот при многократном увеличении селективности (таблица 1). Мы предположили, что усиление антилейшманиозной активности было связано с увеличением доставки клеток-хозяев. Если бы это было так, то блокирование пути поглощения с использованием dynasore подавило бы внутриклеточное уничтожение амастигот PHMB. Соответственно, мы определили эффективность PHMB или его полиплексов против внутриклеточных амастигот в присутствии / отсутствии диназора.Результаты ясно показывают, что dynasore ингибирует PHMB-опосредованное уничтожение амастигот (таблица 2). В присутствии диназора (80 мкМ) значение IC ₅₀ PHMB против внутриклеточных амастигот увеличивалось в два раза, и полиплексы были полностью неактивными до максимальной испытанной дозы (14,2 мкМ) по сравнению с полиплексами без диназора ( 1–2,28 мкМ). Точно так же dynasore подавлял антилейшманиальные эффекты PHMB и полиплексов против промастиготов. Чтобы узнать больше о влиянии dynasore на PHMB-опосредованное уничтожение промастиготов, мы исследовали механизм, с помощью которого промастиготы поглощают PHMB.Мы использовали суб-IC ₅₀ доз PHMB-FITC (0,35 мкМ) и те же ингибиторы, которые использовались ранее с BMDM. Неожиданно результаты показали, что dynasore ингибировал поглощение PHMB-FITC промастиготами более чем на 98%, в то время как другие ингибиторы существенно не влияли на поглощение (S4 фиг.). Сам по себе Dynasore не проявлял цитотоксичности ни в отношении амастигот, ни в отношении промастигот (таблица 2). Таким образом, dynasore спас паразитов от внутриклеточного антилейшманиального действия PHMB, блокируя захват полимера макрофагами, что еще раз подтвердило его внутриклеточный убивающий потенциал, что согласуется с нашими доказательствами механизма действия на уровне ДНК.Более того, результаты показывают, что dynasore также блокирует поглощение PHMB промастиготами и, следовательно, снижает антилейшманиозные эффекты. Взятые вместе, результаты предполагают, что PHMB является эффективным антилейшманиальным соединением и средством, способствующим проникновению нуклеиновых кислот в терапию, направленную на хозяина и патогены.

Наконец, чтобы оценить, обладает ли PHMB иммуномодулирующими свойствами и влияет ли образование полиплексов на иммуномодулирующие свойства CpG ODN, концентрации нескольких ключевых цитокинов были измерены с помощью иммуноферментного анализа (ELISA), взятого из супернатантов совместно культивируемых BMDM.Для свободных CpG ODN продукция всех тестируемых цитокинов увеличивалась с увеличением доз (фиг. 8). Нам не удалось получить надежные измерения IL-4 и TNF-α в клетках, обработанных полиплексами или свободными компонентами (таблица S2). Мы также наблюдали, что один PHMB стимулировал выработку провоспалительных цитокинов, таких как IL-6, IL-10 и IL-12, путем активации макрофагов (S5 фиг.). Более того, на основании измерений IL-6, IL-12 и IL-10 полиплексы обычно проявляли более высокую способность к иммунной стимуляции по сравнению со свободным CpG ODN.Это говорит о том, что компоненты полиплекса являются биоактивными после доставки в BMDM; другими словами, PHMB должен высвобождать CpG ODN из полиплексов внутри BMDM.

Рис. 8. Влияние полиплексов CpG ODN и PHMB / CpG ODN на продукцию цитокинов BMDM.

Гистограммы показывают уровни продукции (ab) IL-6, (cd) IL-10 и (ef) IL-12 после добавления полиплексов CpG ODN или PHMB / CpG ODN к BMDM, которые были предварительно активированы CpG ODN (15 мкг / мл) в течение 30 мин и дополнительно инкубировали в течение 48 ч.Контроли представляли собой клетки без какой-либо предварительной стимуляции, а дозы 0 мкМ представляли собой клетки, предварительно стимулированные CpG ODN, но без какой-либо дополнительной стимуляции CpG ODN или комплексом. Концентрации, указанные для полиплексов, представляют собой дозу PHMB, а концентрации CpG ODN составляют половину указанных доз. Планки погрешностей показывают стандартные ошибки трех независимых экспериментов.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004041.g008

Обсуждение

Терапия лейшманиоза основывается только на нескольких химиотерапевтических средствах, все из которых не обладают соответствующей эффективностью, безопасностью и доступностью.Многие лекарства, используемые в качестве противопаразитарных средств, были перенесены из других областей болезней [14], и эта стратегия кажется подходящей для лечения лейшманиоза, когда требуется очень низкая стоимость товаров. Здесь мы демонстрируем, что давно зарекомендовавший себя антимикробный полимер PHMB является мощным антилейшманиозным кандидатным лекарственным средством для местного применения против CL. PHMB более эффективен, чем существующие стандартные антилейшманиальные препараты in vitro , и может обеспечить дополнительные преимущества за счет заживления ран, иммуномодуляции и доставки дополнительных лекарств в клетки.

PHMB — это очень недорогое соединение (около 10-50 долларов / кг), которое широко используется в клиниках, домах и в промышленности в качестве дезинфицирующего и антисептического средства с отличной переносимостью более 50 лет во всем мире [40,45–47]. Он имеет солидные показатели безопасности и широко считается полезным при лечении ран [29,48]. Как типично для катионных полимеров, токсичность для клеток наблюдается при высоких концентрациях. Было обнаружено, что токсичность PHMB была неожиданно высокой в ​​отношении BMDM, но значительно снижалась при комплексировании с ODN, предположительно из-за образования комплекса / экранирования заряда, при сохранении антилейшманиальных эффектов (таблица 1).Таким образом, PHMB может быть изменен и потенциально использован в качестве эффективного местного лекарственного средства против CL после соответствующих клинических испытаний, а образование комплекса с иммуномодулирующими олигонуклеотидами CpG может обеспечить дополнительные преимущества.

Наши результаты показывают, что PHMB напрямую убивает паразитов посредством двойного механизма, включающего как проницаемость мембран паразитов, так и избирательную конденсацию и разрушение хромосом паразитов. Недавно было показано, что PHMB легко проникает в различные виды бактерий и убивает посредством хромосомной конденсации (Chindera et al., Отправлено). Точно так же наши результаты показывают, что PHMB конденсирует или повреждает хромосомы паразита, но не проникает в ядра макрофагов. Таким образом, открытие помогает объяснить, как PHMB убивает паразитов без аналогичного повреждения клеток-хозяев.

Успешная химиотерапия инфекционных заболеваний, вызванных внутриклеточными возбудителями, в т.ч. L . major , включает модуляцию иммунитета хозяина для лечения, направляемого хозяином. Было показано, что рекомендованные антилейшманиозные препараты обладают иммуномодулирующими свойствами и частично оказывают свое действие через иммуномодуляцию хозяина [49,50].Таким образом, комбинированная терапия, включающая компоненты, которые могут непосредственно убивать патоген, а также активировать иммунную систему хозяина, является привлекательной. Нуклеиновые кислоты, такие как CpG ODN, потенциально могут применяться как в качестве адъювантов, так и в качестве неспецифических иммуномодуляторов, вызывая иммунитет против внутриклеточных патогенов, таких как L . основной [43]. Они также открывают большие перспективы для лечения многих заболеваний в качестве медиаторов подавления РНК и вакцинации. Однако их медицинское применение серьезно затруднено из-за их нестабильности в биологических жидкостях и плохого клеточного поглощения [51].Кроме того, ключевой задачей является эффективная и безопасная доставка иммуномодуляторов на основе нуклеиновых кислот. Комплексирование нуклеиновых кислот с клинически совместимыми полимерами с образованием наночастиц может преодолеть проблемы доставки за счет улучшения прохождения через физиологические или клеточные барьеры. В контексте терапии, направленной на хозяина и патоген, мы исследовали потенциал доставки нуклеиновых кислот PHMB, а также общий синергетический эффект комбинированной терапии, включающей комплексы PHMB и CpG ODN против CL.PHMB и CpG ODN образуют самособирающиеся наноструктуры, которые легко захватываются макрофагами, повышая эффективность поглощения нуклеиновых кислот и повышая эффективность и селективность PHMB против паразитов. В принципе, полиплексный состав может улучшить доставку и обеспечить замедленное высвобождение.

Потенциальные антилейшманиальные эффекты PHMB имеют три аспекта. Во-первых, он может ускорить закрытие раны, тем самым улучшая косметический результат ХЛ и предотвращая вторичные бактериальные и / или грибковые инфекции, которые часто задерживают заживление ран у пациентов с ХЛ [52].Во-вторых, он может напрямую убивать паразитов, вызывающих поражения. В-третьих, антилейшманиозным эффектам PHMB может дополнительно способствовать его способность доставлять иммуномодулирующие агенты, такие как CpG ODN. Открытие взаимодействий PHMB с нуклеиновой кислотой и формирование нанополиплексов для эффективной доставки в макрофаги может иметь широкое применение, выходящее за рамки первоначальных целей этого исследования, включая терапию других внутриклеточных патогенов или неинфекционных заболеваний.

Дополнительная информация

S3 Рис.Доставка CpG ODN в макрофаги с помощью PHMB.

Потенциал клеточного поглощения полиплексов (a) PHMB / CpG-R и (b) PHMB-FITC / CpG ODN и ингибирование dynasore. Свободные полиплексы PHMB-FITC, PHMB-FITC / CpG ODN и PHMB / CpG-R эффективно блокировались dynasore. На основании их MFI поглощение CpG-R было увеличено примерно в 15 раз в виде полиплексной формы по сравнению с его свободной формой.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004041.s003

(TIF)

S4 Рис. Поглощение PHMB-FITC промастиготами и эффекты селективных ингибиторов эндоцитоза.

Гистограммы показывают влияние различных ингибиторов на блокирование поглощения PHMB-FITC промастиготами. Нормализованные значения средней интенсивности флуоресценции (MFI) трех независимых экспериментов проточной цитометрии изображены как среднее ± стандартная ошибка.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004041.s004

(TIF)

S2 Стол. Измерения продукции IL-4 и TNF-α.

Расчетные концентрации продукции (a) IL-4 и (b) TNF-α в нг / мл после обработки PHMB (строки 3 и 4), CpG ODN (строки 5 и 6) или полиплексов PHMB / CpG ODN (строки 7 и 8) при разных концентрациях.Строки 1 и 2 представляют собой серийно разведенные (1: 1) стандарты. Строки 9A и 10A — контрольные.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004041.s007

(TIF)

Благодарности

Авторы благодарны профессору д-ру Ричарду Люциусу, специалисту по молекулярной паразитологии, Университет Гумбольдта, Берлин, за его научную поддержку. Благодарим профессора д-ра Георга Кроне, Даниэлу Бунзен и Клаудию Гериг, биоцентр Университета Вюрцбурга, основной блок электронной микроскопии, за их помощь в подготовке образцов и визуализации для ПЭМ.Мы также благодарим Елену Кацович, Институт биологии молекулярных инфекций, Вюрцбургский университет, за техническую помощь.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: RF LG HM LM TAO. Проведены эксперименты: RF MCA KC MS BR NH TL NFK. Проанализированы данные: РФ МКА БР ЛГ. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: RF LG HM LM TAO. Написал статью: РФ LG HM LM TAO TL NH NFK.

Список литературы

1. 1. Цой CM, Лернер Э.А.Лейшманиоз как развивающаяся инфекция. J Investigate Dermatol Symp Proc. 2001; 6: 175–82. pmid: 11924824
2. 2. Всемирная организация здравоохранения. Серия технических отчетов по борьбе с лейшманиозами. Женева, 22–26 марта. 2010; 949: 1–187.
3. 3. Morizot G, Kendjo E, Mouri O, Thellier M, Pérignon A, Foulet F и др. Путешественники с кожным лейшманиозом излечиваются без системной терапии. Clin Infect Dis. 2013; 57: 370–80. pmid: 23633111
4. 4. Эйрас Д.П., Киркман Л.А., М.Х., Дэниел П.Эйрас, Лаура А. Киркман HWM. Кожный лейшманиоз: современные методы лечения в США возвращающихся путешественников. Варианты лечения Curr Infect Dis. 2015; 7: 52–62. pmid: 25788870
5. 5. Локвуд Д. Солдаты сражаются с «Багдадским кипением». Nat Med. 2004. 10: 110–110.
6. 6. Альвар Дж., Велес И.Д., Берн С., Эрреро М., Дежо П., Кано Дж. И др. Лейшманиоз во всем мире и глобальные оценки его заболеваемости. PLoS One. 2012; 7: e35671. pmid: 22693548
7. 7. Хартли М.А., Дрекслер С., Ронет С., Беверли С.М., Фазель Н.Иммунологические, экологические и филогенетические виновники метастатического лейшманиоза. Trends Parasitol. 2014; 30: 412–22. pmid: 24954794
8. 8. МакКолл Л-И, МакКерроу Дж. Х. Детерминанты фенотипа заболевания у трипаносоматидных паразитов. Trends Parasitol. 2014; 30: 342–9. pmid: 24946952
9. 9. Hurdayal R, Brombacher F. Роль IL-4 и IL-13 в кожном лейшманиозе. Immunol Lett. 2014; 161: 179–83. pmid: 24412597
10. 10. Гонсалес-Леаль И.Дж., Рёгер Б., Шварц А., Ширмейстер Т., Райнхекель Т., Лутц МБ и др.Катепсин B в антигенпрезентирующих клетках контролирует медиаторы иммунного ответа Th2 во время инфекции Leishmania major . PLoS Negl Trop Dis. 2014; 8: e3194. pmid: 25255101
11. 11. Schamber-Reis BLF, Petritus PM, Caetano BC, Martinez ER, Okuda K, Golenbock D, et al. UNC93B1 и Toll-подобные рецепторы, чувствительные к нуклеиновым кислотам, опосредуют устойчивость хозяина к инфекции Leishmania major. J Biol Chem. 2013; 288: 7127–36. pmid: 23325805
12. 12. Momeni AA, Rasoolian M, Navaei A, Emami S, Shaker Z, Mohebali M и др.Разработка липосом с антилейшманиозными препаратами для лечения кожного лейшманиоза. J Liposome Res. 2013; 23: 134–44. pmid: 23350940
13. 13. Сундар С., Чакраварти Дж. Лейшманиоз: обновление текущей фармакотерапии. Эксперт Opin Pharmacother. 2013; 14: 53–63. pmid: 23256501
14. 14. Эндрюс К.Т., Фишер Г., Скиннер-Адамс Т.С. Перепрофилирование лекарств и паразитарные простейшие болезни человека. Int J Parasitol Drugs Drug Resist. 2014; 4: 95–111. pmid: 25057459
15. 15.Монж-Майо Б., Лопес-Велес Р. Терапевтические возможности для кожного лейшманиоза старого мира и кожного и слизисто-кожного лейшманиоза нового мира. Наркотики. 2013; 73: 1889–920. pmid: 24170665
16. 16. Фон Стебут Э. Лейшманиоз. JDDG J der Dtsch Dermatologischen Gesellschaft. 2015; 13: 191–201.
17. 17. Бейли MS. Комментарий редакции: местные методы лечения кожного лейшманиоза. Clin Infect Dis. 2013; 57: 381–3. pmid: 23633110
18. 18. Морено Э., Шварц Дж., Фернандес К., Санмартин С., Нгуева П., Ираче Дж. М. и др.Наночастицы как многофункциональные устройства для местного лечения кожного лейшманиоза. Мнение эксперта Drug Deliv. 2014; 11: 579–97. pmid: 24620861
19. 19. Бен Салах А., Бен Мессауд Н., Гедри Э., Заатур А., Бен Алайя Н., Беттаиб Дж. И др. Паромомицин для местного применения с гентамицином или без него при кожном лейшманиозе. N Engl J Med. 2013; 368: 524–32. pmid: 23388004
20. 20. Карнейро Дж., Сантос Д.С., Оливейра М.К., Фернандес А.П., Феррейра Л.С., Рамальдес Г.А. и др. Местная доставка и антилейшманиальная активность in vivo липосом, нагруженных паромомицином, для лечения кожного лейшманиоза.J Liposome Res. 2010; 20: 16–23. pmid: 19530897
21. 21. Карнейро Дж., Агияр М.Г., Фернандес А.П., Феррейра ЛАМ. Системы доставки лекарств для местного лечения кожного лейшманиоза. Мнение эксперта Drug Deliv. 2012; 9: 1083–97. pmid: 22724539
22. 22. Джаббур М.Н., Исса Дж., Чарафеддин К., Симан Й., Карам М., Халифе Х. и др. Иммунная микросреда при кожном лейшманиозе. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2014.
23. 23. Гупта С., Сане С.А., Шакья Н., Вишвакарма П., Хак В.CpG-олигодезоксинуклеотид 2006 и милтефозин, потенциальная комбинация для лечения экспериментального висцерального лейшманиоза. Антимикробные агенты Chemother. 2011; 55: 3461–4. pmid: 21537026
24. 24. Лима-Джуниор Д.С., Коста Д.Л., Каррегаро В., Кунья Л.Д., Сильва АЛН, Минео TWP и др. Продукция IL-1β, производная инфламмасом, вызывает опосредованную оксидом азота устойчивость к Leishmania. Nat Med. 2013; 19: 909–15. pmid: 23749230
25. 25. Датта Н., Мукерджи С., Дас Л., Дас ПК. Нацеливание на иммуностимулирующую ДНК излечивает экспериментальный висцеральный лейшманиоз за счет активации оксида азота и активации Т-клеток.Eur J Immunol. 2003. 33: 1508–18. pmid: 12778468
26. 26. Ямамото М., Сато Т., Берен Дж., Вертели Д., Клинман Д.М. Ускорение заживления ран у приматов путем местного введения иммуностимулирующих CpG-олигонуклеотидов. Биоматериалы. 2011; 32: 4238–42. pmid: 21421264
27. 27. Сато Т., Ямамото М., Симосато Т., Клинман Д.М. Ускоренное заживление ран, опосредованное активацией Toll-подобного рецептора 9. Восстановление заживления ран. 2010; 18: 586–93. pmid: 20946144
28. 28.Аревало I, Туллиано Дж., Киспе А., Спет Дж., Матлашевски Дж., Льянос-Куентас А. и др. Роль имиквимода и парентерального антимониата меглумина в начальном лечении кожного лейшманиоза. Clin Infect Dis. 2007. 44: 1549–1554. pmid: 17516397
29. 29. Герит Д. Малдер, Джозеф П. Каворси DKL. Полигексаметилен бигуанид (PHMB): дополнение к текущим противомикробным препаратам для местного применения. Раны ,. 2007. 19: 173–182.
30. 30. Самал С.К., Даш М., Ван Влиерберг С., Каплан Д.Л., Кьеллини Е., ван Блиттерсвейк С. и др.Катионные полимеры и их терапевтический потенциал. Chem Soc Rev.2012; 41: 7147–94. pmid: 22885409
31. 31. Кармона-Рибейро AM, де Мело Карраско LD. Катионные противомикробные полимеры и их сборки. Int J Mol Sci. 2013; 14: 9906–46. pmid: 23665898
32. 32. Фирдесса Р., Эльшлегер Т.А., Молл Х. Идентификация множественных клеточных путей поглощения наночастиц полистирола и факторов, влияющих на поглощение: актуальность для систем доставки лекарств. Eur J Cell Biol.2014; 93: 323–37. pmid: 25224362
33. 33. Понте-Сукре А., Гульдер Т., Вегехаупт А., Альберт С., Риканович С., Шефляйн Л. и др. Взаимосвязь структура-активность и исследования молекулярного механизма лейшманицидных N, C-связанных солей арилизохинолиния. J Med Chem. 2009. 52: 626–36. pmid: 115
34. 34. Брингманн Г., Томале К., Бишоф С., Шнайдер С., Шультейс М., Шварц Т. и др. Новый анализ на основные амастиготы Leishmania в 96-луночном формате для быстрого скрининга лекарств и его использование для открытия и оценки нового класса лейшманицидных солей хинолиния.Антимикробные агенты Chemother. 2013; 57: 3003–11. pmid: 23587955
35. 35. Lang T, Goyard S, Lebastard M, Milon G. Биолюминесцентная лейшмания, экспрессирующая люциферазу, для быстрого и высокопроизводительного скрининга лекарств, действующих на макрофаги, несущие амастиготы, и для количественного мониторинга в реальном времени признаков паразитизма у живых мышей. Cell Microbiol. 2005; 7: 383–92. pmid: 15679841
36. 36. Chekeni FB, Elliott MR, Sandilos JK, Walk SF, Kinchen JM, Lazarowski ER, et al.Каналы паннексина 1 обеспечивают высвобождение сигнала «найди меня» и проницаемость мембран во время апоптоза. Природа. 2010; 467: 863–7. pmid: 20944749
37. 37. О’Мэлли LP, Хассан К.З., Бриттан Х., Джонсон Н., Коллинз А.Н. Характеристика биоцида полигексаметиленбигуанида с помощью матричной лазерной десорбционной ионизации времяпролетной масс-спектрометрии. J Appl Polym Sci. 2006. 102: 4928–4936.
38. 38. Икеда Т., Тазуке С., Ватанабе М. Взаимодействие биологически активных молекул с фосфолипидными мембранами.I. Изучение флуоресцентной деполяризации влияния полимерного биоцида, содержащего бигуанидные группы в основной цепи. Biochim Biophys Acta. 1983; 735: 380–6. pmid: 6639946
39. 39. Rusciano G, Capriglione P, Pesce G, Del Prete S, Cennamo G, Di Cave D и др. Рамановский микроскопический анализ в лечении акантамебного кератита. PLoS One. 2013; 8: e72127. pmid: 23977228
40. 40. Wessels S, Ingmer H. Механизмы действия трех дезинфицирующих активных веществ: обзор.Regul Toxicol Pharmacol. 2013; 67: 456–67. pmid: 24080225
41. 41. Аллен М.Дж., Морби А.П., Уайт Г.Ф. Кооперативность в связывании катионного биоцида полигексаметиленбигуанида с нуклеиновыми кислотами. Biochem Biophys Res Commun. 2004; 318: 397–404. pmid: 15120614
42. 42. Кастильо Б., Бромберг Л., Лопес Х, Бадильо В., Гонсалес Фелисиано Х.А., Гонсалес К.И. и др. Внутриклеточная доставка миРНК поликатионными суперпарамагнитными наночастицами. J Drug Deliv. 2012; 2012: 218940.pmid: 22970377
43. 43. Ramírez-Pineda JR, Fröhlich A, Berberich C, Moll H. Дендритные клетки (DC), активированные CpG ДНК ex vivo, являются мощными индукторами устойчивости хозяина к внутриклеточному патогену, который не зависит от IL-12, полученного из иммунизирующих DC. J Immunol. 2004; 172: 6281–9. pmid: 15128817
44. 44. Ново Л., Риццо Л. Я., Голомбек С. К., Даквар Г. Р., Лу Б., Ремаут К. и др. Декатионизированные полиплексы как стабильные и безопасные системы-носители для улучшенного биораспределения в системной генной терапии.J Control Release. 2014; 195: 162–75. pmid: 25204289
45. 45. Каен К. Полигексанид: безопасный и высокоэффективный биоцид. Skin Pharmacol Physiol. 2010; 23 Дополнение: 7–16. pmid: 20829657
46. 46. Walls G, Noonan L, Wilson E, Holland D, Briggs S. Успешное использование местного полигексаметилен бигуанида в качестве дополнения к лечению грибкового остеомиелита. Может ли J заразить Dis Med Microbiol. 2013; 24: 109–12. pmid: 24421812
47. 47. Мюллер Г., Кобургер Т., Крамер А.Взаимодействие гидрохлорида полигексаметиленбигуанида (PHMB) с фосфатидилхолином, содержащим эмульсию в / в, и последствия для микробицидной эффективности и цитотоксичности. Chem Biol Interact. 2013; 201: 58–64. pmid: 23313712
48. 48. Hirsch T, Jacobsen F, Rittig A, Goertz O, Niederbichler A, Steinau HU и др. [Сравнительное исследование in vitro клеточной токсичности клинически используемых антисептиков]. Hautarzt. 2009; 60: 984–91. pmid: 19812986
49. 49. Das S, Rani M, Rabidas V, Pandey K, Sahoo GC, Das P.TLR9 и MyD88 имеют решающее значение для созревания и активации дендритных клеток с помощью комбинированной терапии паромомицином и милтефозином при висцеральном лейшманиозе. Br J Pharmacol. 2014; 171: 1260–74. pmid: 24670148
50. 50. Гош М., Рой К., Рой С. Иммуномодулирующие эффекты антилейшманиозных препаратов. J Antimicrob Chemother. 2013; 68: 2834–8. pmid: 23833177
51. 51. Инь Х, Канасты Р.Л., Эльтоухи А.А., Вегас А.Дж., Доркин Дж.Р., Андерсон Д.Г. Невирусные векторы для генной терапии.Nat Rev Genet. 2014; 15: 541–55. pmid: 25022906
52. 52. Джебран А.Ф., Шлейхер У., Штайнер Р., Венткер П., Махфуз Ф., Шталь Х.С. и др. Быстрое заживление кожного лейшманиоза с помощью высокочастотной электрокаутеризации и обработки ран гидрогелем с использованием или без DAC N-055: рандомизированное контролируемое исследование фазы IIa в Кабуле. PLoS Negl Trop Dis. 2014; 8: e2694. pmid: 24551257

енотовидных патогенов, важных для человека — вирусы и бактерии

Северные еноты ( Procyon lotor , рис. 1) могут переносить множество болезней, которые представляют серьезную опасность для здоровья как людей, так и домашних животных.Некоторые из этих заболеваний протекают бессимптомно, не проявляют признаков инфекции и часто не поражают енотов, но все же могут передаваться и быть смертельными для других животных, включая человека. Поскольку невозможно быть уверенным в том, что дикое животное болеет, безопаснее считать животное опасным и избегать его. Обратитесь в службу контроля за животными или к специалисту по реабилитации диких животных, если вы подозреваете, что животное болеет или ведет себя ненормально (контактные данные специалистов по реабилитации диких животных Флориды можно найти на веб-сайте Комиссии по охране рыб и дикой природы Флориды).Больные дикие животные могут вести себя прирученными и сбитыми с толку, но никогда не следует приближаться к ним, как к прирученным. Они по-прежнему дикие животные, которые, вероятно, будут рассматривать вас как угрозу и могут действовать агрессивно. Из-за успешной адаптации к городской среде еноты часто контактируют с людьми. Этот документ является частью серии, посвященной опасностям для здоровья, связанным с енотами, и конкретно описывает наиболее важные вирусы и бактерии, переносимые енотами. Информацию о других паразитах, переносимых енотами, а также более подробную информацию о круглых червях енотовидных Baylisascaris procyonis можно найти в других документах этой серии.Следующие вирусы и бактерии, как известно, встречаются у енотов и вызывают беспокойство у людей и / или домашних животных: бешенство, чума собак, чума / панлейкопения кошек, парвовирус собак, Salmonella , туляремия, септицемия Edwardsiella и лептоспироз (см. Таблица 1 для обобщения и профилактики).

Вирусы

Бешенство

Бешенство — это вирус рибонуклеиновой кислоты (РНК) из семейства Rhabdoviridae и одно из самых смертоносных известных заболеваний.Если не лечить на ранней стадии, бешенство почти на 100 процентов приводит к летальному исходу. Около десятка человек в зарегистрированной истории заразились бешенством и выжили без своевременного лечения бешенства и вакцинации до или после контакта. Напротив, во всем мире от бешенства ежегодно умирает более 59 000 человек. Ежегодно в Соединенных Штатах происходит от 1 до 2 смертельных случаев; однако тысячи людей обращаются за постконтактным лечением. Большинство смертей от бешенства происходит в Африке и Азии, где вакцинация и лечение не так доступны.Множество организаций, включая Центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC) и Всемирную организацию здравоохранения (ВОЗ), стремятся к 2030 году положить конец всем смертям от бешенства среди людей с помощью вакцинации и обучения.

Бешенство передается со слюной инфицированных млекопитающих, включая летучих мышей, енотов, скунсов, лисиц, собак, других собак, кошек и домашний скот. Теоретически бешенством может заразиться любое млекопитающее, хотя о перечисленных выше случаях сообщается больше всего. Во всем мире 99 процентов случаев заболевания людей вызваны непривитыми собаками.Однако в Соединенных Штатах обязательная вакцинация собак значительно снизила количество случаев заболевания собак и, следовательно, количество случаев заражения людей бешенством. Большая часть воздействия на человека (92,7 процента в 2018 году) в Соединенных Штатах происходит от видов диких животных (летучие мыши 33 процента, еноты 30,3 процента, скунсы 20,3 процента и лисы 7,2 процента), а большинство человеческих смертей от бешенства происходит от летучих мышей. В этих случаях жертва не знала, что летучие мыши подвержены риску заражения бешенством, или не осознавала, что их укусили.Текущие данные CDC о бешенстве в США можно найти на их веб-сайте. Данные показывают, что, хотя летучие мыши, больные бешенством, встречаются во всех штатах, кроме Гавайев, варианты бешенства, связанные с плотоядными животными среднего размера, географически отличаются в Соединенных Штатах (рис. 2). В частности, еноты служат резервуаром бешенства на юге и востоке США. Это не означает, что еноты — единственный вид, который может заразиться бешенством в этом районе; возможна межвидовая передача вариантов вируса бешенства (например, заражение собак вариантом бешенства енота).К счастью, вакцинация домашних животных и образование значительно снизили количество случаев бешенства среди людей и домашних животных во многих регионах мира.

Бешенство может вызывать агрессивное поведение и повышенное слюноотделение; однако это далеко не единственные симптомы. Бешеное животное также может вести себя прирученно, становиться активным в необычные часы или проявлять неврологические отклонения. Еноты иногда будут добывать пищу в течение дня, если будет тихо, поэтому дневное наблюдение за енотом само по себе не является поводом для беспокойства.Однако, если енот не боится людей или демонстрирует неврологические отклонения, он может быть бешеным. В любом случае, енотов, как и всех диких животных, следует избегать.

Бешенство наблюдается в каждом округе штата Флорида (рис. 3, таблица 2). Департамент здравоохранения Флориды ежегодно публикует отчеты о зарегистрированных случаях, которые можно найти на веб-сайте Департамента здравоохранения Флориды. В 2017 году среди диких животных было зарегистрировано 78 случаев бешенства, 36 из которых были от енотов.

Предэкспозиционная вакцинация

Предэкспозиционная вакцинация против бешенства доступна для людей, но даже если предконтактная вакцинация проводится, по-прежнему необходимо немедленно обратиться за лечением после контакта с потенциально бешеным животным .Из-за высокой стоимости (предэкспозиционная вакцинация в США может стоить более 1000 долларов) профилактическое лечение рекомендуется только людям, которые с большей вероятностью контактируют с бешеными животными, например ветеринарам, исследователям, смотрителям зоопарка, диким животным. специалисты по реабилитации, инспекторы по контролю за животными или люди, путешествующие в регионы, где широко распространено бешенство. Вакцинацию можно получить в кабинетах врачей, туристических клиниках и больницах. Предэкспозиционная вакцинация состоит из трех прививок в 1, 7, 21 или 28 день.Предэкспозиционная вакцинация устраняет необходимость в дорогостоящем лечении иммуноглобулином, но все же необходимо модифицированное постконтактное лечение для защиты пациента от заражения бешенством. Если человеку не сделана предконтактная вакцинация, а это подавляющее большинство людей, то требуется другой курс лечения (см. Следующий раздел).

Также доступны прививки для животных. Вакцинация собак от бешенства обязательна по закону во всех 50 штатах, а кошек и хорьков — в большинстве штатов, включая Флориду.Стоимость намного дешевле, примерно от 20 до 30 долларов за выстрел в год. Дикие животные также могут быть вакцинированы, и ежегодно Служба охраны дикой природы Службы инспекции здоровья животных и растений Министерства сельского хозяйства США (USDA) прилагает большие усилия для распространения пероральной вакцины против бешенства с целью сокращения распространения бешенства енотов. на запад. Более подробную информацию, включая карту, можно найти на веб-сайте USDA. Бешенство енотов — преобладающий тип бешенства во Флориде.Частоту распространения бешенства, передаваемого енотами во Флориде, с течением времени можно найти на Рисунке 4.

Постэкспозиционная обработка

Без документации о текущей вакцинации против бешенства рассматривать укус любого млекопитающего как возможный случай заражения бешенством. Не подвергайте себя опасности, пытаясь собрать потенциально бешеного енота. Вместо этого сообщите в службу контроля животных. Кошку или собаку можно наблюдать в течение десяти дней для выявления клинических признаков.Недостаточно подтверждающих данных относительно сроков распространения вируса, чтобы доказать, что одного наблюдения достаточно для других животных. К сожалению, единственный быстрый и надежный тест включает рассечение мозга, поэтому требуется эвтаназия животного.

Если есть вероятность заражения бешенством, крайне важно начать лечение сразу после укуса или царапины. Поскольку вирус находится в слюне, бешеному животному не нужно укусить, чтобы передать бешенство: оно может передать болезнь, облизывая поврежденную кожу.Немедленно промойте раны. Один из наиболее эффективных способов снизить вероятность заражения — тщательно промыть рану водой с мылом. Постэкспозиционную обработку следует начинать сразу после контакта. Рекомендации Всемирной организации здравоохранения по постэкспозиционной обработке можно найти на их веб-сайте. Постэкспозиционное лечение доступно в отделениях неотложной помощи и окружных отделениях здравоохранения. CDC также рекомендует проводить вакцинацию против столбняка, которую необходимо делать каждые 10 лет.

Постэкспозиционная терапия состоит из четырех-пяти уколов в очаг инфекции или в руку. Уколы делают в дни 0, 3, 7 и 14, а для пациентов с ослабленной иммунной системой иногда — на 28 день. Человеческий антирабический иммуноглобулин, состоящий из антител против бешенства, также вводят в день 0. Всем, кто был вакцинирован ранее. в дни 0 и 3 пациенту делаются ревакцинации, но иммуноглобулин отсутствует. Помните, что независимо от стоимости или тяжелых испытаний, альтернативой является потенциально неизлечимая смертельная болезнь.Постконтактная вакцинация оказалась весьма успешной в снижении числа случаев смерти людей от бешенства в Соединенных Штатах с более чем 100 случаев в год до 1–2 случаев в год. Эти случаи обычно ограничиваются людьми, которые не знали, что они подверглись воздействию бешеного животного, не знали о риске контакта с дикими животными или были укушены собакой в ​​чужой стране и не обращались за лечением. Если вы подозреваете, что могли подвергнуться контакту с бешеным животным, обратитесь в отдел здравоохранения вашего округа или в Центры по контролю за заболеваниями; они могут помочь вам определить, подвергались ли вы воздействию.

Дополнительную информацию о бешенстве можно найти в «Фактах о болезнях диких животных: бешенство».

Чума собак

Вирус чумы собак , также известный как Собачий морбилливирус , представляет собой высококонтагиозный РНК-вирус семейства Paramyxoviridae. Собачья чума является основной естественной причиной смерти енотов сразу после человеческих смертей. Вирус чумы собак не может заразить людей, но он может заразить и убить многих хищников, включая псовых, медведей, куньих (ласки, хорьки, скунсы и т. Д.).), крупные представители семейства кошачьих (не включая домашних домашних кошек), проциониды (еноты, кинкажу, рингтейлы и т. д.) и тюлени. В то время как каждая группа упомянутых млекопитающих находится в зоне риска, инфекция у собак, по-видимому, наиболее распространена и является серьезной проблемой для домашних собак. Вакцинация для собак стоит недорого, и ее можно легко получить в кабинетах ветеринаров или передвижных клиниках. Вирусы, вызывающие чумку собак и кошек (см. Следующий раздел), не связаны между собой, и клинические признаки различаются. Оба вируса могут заразить енотов и являются очень серьезными заболеваниями.

Симптомы чумы собак могут варьироваться от появления инфекции верхних дыхательных путей (URI) до неврологических признаков, напоминающих бешенство. Он начинается с выделений из носа, лихорадки, конъюнктивита (воспаления и покраснения глаз), вялости, диареи и отсутствия аппетита. По мере развития болезни могут стать очевидными неврологические проблемы. Собаки стали жертвами инфекции с признаками ИВДП или вообще без признаков. Наклон головы, подергивание мышц, дезориентация, судороги и ухудшение моторики можно увидеть на более поздних стадиях.На данный момент заражение вирусом чумы трудно отличить от бешенства.

Вирус передается через прямой или косвенный контакт с инфицированной кровью, слюной или мочой. Хотя специального лечения не существует, симптомы можно облегчить, а животное может получить поддержку и дать ему лучшую возможность выздороветь, используя его собственную иммунную систему. Выжившие животные могут проявлять пожизненные симптомы, начиная от затвердевания подушечек лап и заканчивая глазными или неврологическими симптомами.

Чума кошачья / панлейкопения

Чума кошек , также известная как панлейкопения кошек (FP), представляет собой заболевание, вызываемое высококонтагиозным парвовирусом кошек.Это не связано с чумой собак, но также смертельно опасно для енотов. Парвовирус кошек не может заразить людей, но может заразить и убить кошек. Отбеливатель можно использовать как дезинфицирующее средство; вирус устойчив ко многим другим химическим веществам. Вакцинация стоит дешево и легко доступна в ветеринарных кабинетах и ​​мобильных клиниках. Он наиболее опасен для котят и кошек с ослабленной иммунной системой. В остальном здоровые взрослые кошки имеют неплохие шансы на выживание.

Симптомы включают жар, депрессию, анорексию, обезвоживание, рвоту, диарею, боль в животе, а иногда и отсутствие симптомов.Лечение является поддерживающим и состоит из введения жидкостей, переливания крови или плазмы и антибиотиков при вторичных инфекциях.

Парвовирус кошек распространяется через носовые выделения, кровь, фекалии, мочу или блох, которых кормило инфицированное животное. Он также может передаваться через плохую гигиену рук, посуду для кормления и другие материалы. Парвовирус кошек быстро атакует, деля клетки крови в костном мозге, кишечном эпителии и лимфатических узлах. Если кошка выживает, долгосрочные последствия обычно отсутствуют.

Парвовирус собак

Собачий Parvovirus , или parvo, — это очень заразный вирус семейства Parvoviridae, вызывающий серьезные заболевания у собак. Еноты могут переносить этот патоген бессимптомно, но он может убить невакцинированных собак. Вакцины против парвовируса недороги, их можно приобрести у ветеринаров и передвижных клиник.

Этот вирус поражает желудочно-кишечный тракт собаки. Парвовирусы обладают высокой устойчивостью к жаре, холоду и сушке и могут выживать в окружающей среде в течение длительных периодов времени.Отбеливатель можно использовать как дезинфицирующее средство; вирус устойчив ко многим другим химическим веществам. Он передается при прямом контакте с инфицированным животным, зараженными поверхностями или фекалиями. Признаки у собак включают потерю аппетита, боль в животе и вздутие живота, лихорадку, низкую температуру тела, диарею, рвоту и вялость. Большинство смертей наступает через 48-72 часа после появления симптомов.

Лечение является поддерживающим и включает нутритивную поддержку, борьбу с обезвоживанием, рвотой и диареей, а также лечение вторичных инфекций.Даже при поддерживающем лечении собака может погибнуть от инфекции. Особенно это актуально для щенков.

Бактерии

Сальмонелла

Salmonella — частая причина пищевых отравлений. Симптомы включают рвоту, жар и диарею. Эти симптомы обычно проходят через 3-8 дней без лечения. Однако иногда в тяжелых случаях требуются антибиотики или госпитализация. Подробная информация о Salmonella доступна в серии документов EDIS. Инфекция Salmonella чаще всего передается через зараженную пищу, но также может передаваться от инфицированных млекопитающих, птиц и рептилий в результате плохой санитарии, обычно в результате фекально-оральной передачи. По оценкам CDC, Salmonella заражает более миллиона человек в Соединенных Штатах каждый год, вызывая около 20 000 госпитализаций и 400 смертей. Salmonella может также инфицировать домашних млекопитающих и птиц и переноситься без симптомов рептилиями и земноводными.

Францизелла туларенская

Francisella tularensis вызывает туляремию, также известную как кроличья лихорадка, и может передаваться клещами и контактировать с инфицированными тканями млекопитающих. Туляремию сложно диагностировать у людей, и ее можно принять за другие заболевания. Большинство людей выздоравливают, но на это может потребоваться несколько недель лечения антибиотиками. Туляремия обычно не наблюдается у кошек и собак, но когда она заражает их, она может вызвать отказ системы органов, если ее не лечить на ранней стадии и агрессивно.Чтобы диагностировать туляремию, обычно необходимо сначала исключить несколько других заболеваний. Вакцина в настоящее время находится на рассмотрении. Было показано, что еноты сами переносят туляремию и переносят клещей, но неясно, как туляремия влияет на енотов. У людей воздействие может происходить через питье зараженной воды, укусы насекомых, переносящих болезнь, обращение с тушами животных, употребление в пищу недоваренной дичи или вдыхание высушенных инфекционных тканей животных. Еноты могут быть полезны как индикатор наличия туляремии в окружающей среде.

Эдвардсиелла Тарда

Edwardsiella tarda вызывает септицемию Edwardsiella, редкую, но потенциально смертельную инфекцию для людей и диких животных. Однако, E. tarda был обнаружен у здоровых животных, включая енотов. E. tarda был обнаружен в кишечнике многих рыб, рептилий, млекопитающих и птиц и передается через инфицированные фекалии животных. Воздействие загрязненной воды и рыбы являются важными факторами передачи.Фактически, большинство зарегистрированных случаев заболевания животных было связано с видами, тесно связанными с водой. Септицемия Edwardsiella часто вызывает гастроэнтерит. Доступно противомикробное лечение, однако недавний обзор литературы показал, что уровень смертности среди людей даже при лечении составляет 44 процента. Септицемия, вызванная Edwardsiella, остается редкостью, и факторы риска недостаточно изучены.

Лептоспира

Leptospira Бактерии вызывают лептоспироз, который при отсутствии лечения может привести к поражению почек, печеночной недостаточности, менингиту, респираторной недостаточности и смерти.Практически все млекопитающие могут переносить лептоспироз и могут проявлять или не проявлять клинических признаков. Считается, что грызуны являются основным переносчиком. Он передается через загрязненную мочу и воду. Инфекция чаще всего встречается в теплых и влажных местах, но может возникать и в других местах. Лептоспироз наблюдается у собак, но редко встречается у людей в развитых странах. Сообщения о лептоспирозе, когда-то считавшемся заболеванием сельских районов, в городских районах растут, либо из-за увеличения распространенности этого заболевания, либо из-за более частого выявления.

Источники и дополнительная информация

Форрестер Д. Дж. 1992. Паразиты и болезни диких млекопитающих во Флориде . Издательство Университета Флориды, Гейнсвилл. 123–150. http://ufdc.ufl.edu/AA00025659/00001

Керн, У. Х. 2018. Северный енот . WEC-34. Гейнсвилл: Институт пищевых и сельскохозяйственных наук Университета Флориды. https://edis.ifas.ufl.edu/uw033

Бешенство

Клиника Майо. нет данных «Бешенство.»По состоянию на 14 мая 2020 г. https://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/rabies/symptoms-causes/syc-20351821

Всемирная организация здравоохранения. 2020. «Бешенство». https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/rabies

Чума собак

Криви, К. Э. 2018. «Обзор собачьей чумы». Ветеринарное руководство Merck, Merck & Co., Inc. https://www.merckvetmanual.com/generalized-conditions/canine-distemper/overview-of-canine-distemper

Кошачья чума

Сквайрс, Р.A. 2013. «Обзор панлейкопении кошек». Ветеринарное руководство Merck, Merck & Co., Inc. https://www.merckvetmanual.com/generalized-conditions/feline-panleukopenia/overview-of-feline-panleukopenia

Парвовирус собак

Американская ветеринарная медицинская ассоциация. 2013. «Парвовирус собак». https://www.avma.org/resources/pet-owners/petcare/canine-parvovirus-type-2c-faq

де Карденас, C. 2008. «Парво в собаках». Pet MD. https://www.petmd.com/dog/conditions/infectious-parasitic/c_dg_canine_parvovirus_infection

EDIS.нет данных Сальмонелла . По состоянию на 14 мая 2020 г. https://edis.ifas.ufl.edu/topic_salmonella

Уильямс, К. и Р. Даунинг. 2019. «Туляремия у собак». Больницы для животных VCA. https://vcahospitals.com/know-your-pet/tularemia-in-dogs

Хираи Ю., С. Асахата-Таго, Ю. Айнода, Т. Фудзита и К. Кикучи. 2015. » Edwardsiella tarda Bacteremia. Редкая, но смертельная инфекция, передаваемая через воду и продукты питания: обзор литературы и клинических случаев из единого центра.» Канадский журнал инфекционных заболеваний и медицинской микробиологии 26: 313–318. Https://doi.org/10.1155/2015/702615

Уайт, Ф. Х., Дж. Дж. Уотсон, Г. Л. Хофф и У. Дж. Биглер. 1975. « Edwardsiella tarda Инфекции в енотах Флориды, Procyon lotor. » Архивы гигиены окружающей среды: Международный журнал 30: 601–603. https://doi.org/10.1080/00039896.1975.10666788

Лептоспироз

Американская ветеринарная медицинская ассоциация.нет данных «Лептоспироз.» По состоянию на 14 мая 2020 г. https://www.avma.org/public/PetCare/Pages/Leptospirosis.aspx

Центры по контролю и профилактике заболеваний. 2019. «Лептоспироз». https://www.cdc.gov/leptospirosis/index.html

Трэкслер Р. М., Л. С. Каллинан, Р. К. Холман, К. Штайнер и М. А. Герра. 2014. «Госпитализации, связанные с лептоспирозом, США, 1998–2009». Новые инфекционные заболевания 20: 1273–1279. https://dx.doi.org/10.3201/eid2008.130450

Столы

Сводка по вирусам и бактериям, передающимся енотами.

Зарегистрированные случаи бешенства у енотов во Флориде в 1997–2018 гг. По округам (данные Министерства здравоохранения Флориды).

Фактов о желтой лихорадке

Желтая лихорадка (ЖЛ) — это инфекция приматов, переносимая африканскими комарами. Это вызвано вирусом из рода Flavivirus семейства Flaviviridae. В естественной среде обитания он передается между обезьянами через лесных приматофильных комаров Aedes . Вирус и его переносчик ( Ae. Aegypti ) были завезены в Америку, где он также является энзоотическим в лесной среде обитания, благодаря работорговле.

Сильватическое заражение людей происходит, когда они входят в лес для охоты, сбора пищи, заготовки древесины и так далее.Зараженные лесом люди могут инициировать передачу от человека к человеку, если в городах и деревнях присутствуют подходящие перидоместные переносчики. В городской среде Ae. (Stegomyia) aegypti (Linn.), Лесной вид, который адаптировался в домашней среде человека, является высокоэффективным переносчиком вируса желтой лихорадки (YFV). Этот комар также является основным переносчиком вирусов денге и чикунгунья в городах.

Желтая лихорадка распространена в Западной, Центральной и Восточной Африке и в Южной Америке, от Панамы до северной части Аргентины.В Азии он никогда не обнаруживался. В сельских районах Африки были зарегистрированы катастрофические эпидемии, унесшие жизни десятков тысяч человек.

Переносчик Aedes aegypti когда-то был эндемиком в Европе и стал причиной крупных эпидемий YF и денге. Причина его исчезновения после Второй мировой войны так и не была объяснена. Он все еще присутствует в Соединенных Штатах и ​​был зарегистрирован в 21 штате. Вполне возможно, что этот вектор может восстановиться и широко распространиться в Европе, как это произошло в последние годы с другим предполагаемым вектором, Ae.albopictus .

Симптомы появляются внезапно, обычно через 3-5 дней после заражения. Заболевание может вызывать широкий спектр симптомов, от легких до смертельных. В клинических случаях наблюдается внезапное начало лихорадки с сильной головной болью, артралгиями и мышечными болями. Желтуха может появиться на третьи сутки и указывает на плохой прогноз. Повышение уровня трансаминаз также является прогностическим. В тяжелых случаях может наблюдаться спонтанное кровотечение (рвота из кофейной гущи), почечная недостаточность, делирий, кома и смерть.Смертность от этих клинических случаев может достигать 80%, что сопоставимо с Эболой, Марбургом и другими геморрагическими вирусными инфекциями. Период выздоровления длительный, часто с серьезными последствиями.

Вирус циркулирует между обезьянами в лесу и между людьми в деревнях и городах. Основные лесные переносчики размножаются в дуплах деревьев и подобных небольших скоплениях воды. Инфекция у африканских обезьян протекает бессимптомно или в легкой форме; Об эпизоотиях сигнализируют, когда люди заражаются этим заболеванием.Напротив, вирус смертелен для приматов западного полушария; эпизоотии очевидны, «когда джунгли замолкают» из-за высокой смертности обезьян-ревунов.

Укусы инфицированных комаров — единственный путь передачи.

Комары заражаются вирусом, когда питаются вирусом-хозяином, после чего (у восприимчивых видов) вирус поражает многие ткани, включая слюнные железы. Хотя для того, чтобы заразиться, может потребоваться несколько недель (и много еды с кровью), комары инфицированы на всю жизнь.

Новые инфекции у людей могут возникать, когда слюна, содержащая вирус, вводится неиммунному хозяину во время последующего приема пищи кровью. «Внешний инкубационный период», время, необходимое для того, чтобы комар стал заразным, составляет около десяти дней, в зависимости от температуры. Имеются также данные о вертикальной передаче (передача напрямую от взрослых самок комаров через яйца взрослым особям следующего поколения).

Виремия достигает высоких титров за день до появления симптомов и, как правило, достаточно высока, чтобы заразить комаров в течение следующих четырех дней.Иммунитет, наверное, пожизненный.

Все непривитые люди подвержены риску в зонах активной передачи. В последние годы ряд непривитых туристов из Европы и Северной Америки умерли от болезни после посещения энзоотических районов.

Aedes aegypti распространен повсеместно в тропиках, поэтому во многих тропических городах существует реальная и настоящая опасность крупной эпидемии.

Безопасная, эффективная и недорогая аттенуированная вакцина против желтой лихорадки, известная как YF 17D, используется более полувека.Вакцина очень эффективна, но плановая вакцинация проводится очень немногими странами.

Свидетельство о вакцинации против YF — единственное свидетельство о вакцинации, которое требуется при международных поездках. Свидетельство о вакцинации против желтой лихорадки действительно в течение всей жизни вакцинированного человека, начиная с 10 дней после даты вакцинации. Перед вакцинацией следует проводить анализ индивидуального риска и пользы, особенно у пациентов с аутоиммунными заболеваниями, иммунодефицитом или другими сопутствующими сопутствующими заболеваниями, а также среди пожилых людей с учетом пункта назначения и продолжительности поездки, а также вероятности заражения. комары.

В начале 20 века городские YF были изгнаны из многих стран в результате энергичных кампаний по уничтожению Ae. aegypti мест размножения. После Второй мировой войны целенаправленное нанесение ДДТ на зараженные контейнеры и их окрестности имело выдающийся успех. По данным Панамериканской организации здравоохранения, этот вид был уничтожен в 22 странах Америки. В настоящее время заменителей ДДТ нет. Многие органы здравоохранения прибегают к инсектицидным аэрозолям, которые доставляются с ручных машин, дорожных транспортных средств или самолетов.Методика дорогая и малоэффективная. Более того, даже если бы был достигнут высокий уровень смертности, воздействие на взрослое население, вероятно, было бы слишком коротким, чтобы оказать эффективное воздействие на передачу. Всемирная организация здравоохранения в течение нескольких лет рекомендовала «сокращение источников на уровне сообществ», но нет никаких доказательств того, что это было успешным где-либо в мире.

Профилактика также основана на защите от укусов комаров. Комары Aedes в течение дня кусают как в помещении, так и на улице.Поэтому меры индивидуальной защиты следует применять в течение всего дня, особенно в часы наибольшей активности комаров (с утра, после полудня до сумерек). Меры индивидуальной защиты от укусов комаров включают использование противомоскитных сеток (предпочтительно сеток, обработанных инсектицидами), сон или отдых в помещениях с защитными экранами или кондиционерами, ношение одежды, закрывающей большую часть тела, и использование репеллентов от комаров в в соответствии с инструкциями, указанными на этикетке продукта.

Вирус может быть обнаружен в образцах крови с помощью ОТ-ПЦР, захвата антигена и / или выделения вируса. Серологический диагноз может быть поставлен путем обнаружения специфических антител IgM через неделю после заражения. Воздействие вируса YF обеспечивает пожизненный иммунитет.

Поддерживающая терапия — единственный вариант, хотя использование противовирусных препаратов является активной областью исследований. Важно строго избегать приема аспирина и других антикоагулянтов.

Несмотря на обилие информации об экологии, эпидемиологии и патологии болезни, высокая вероятность крупных городских вспышек среди невакцинированного населения остается в районах, где присутствует переносчик Aedes aegypti .

Неблагоприятные (висцеротропные или нейротропные) явления после иммунизации после вакцинации против YF были зарегистрированы в основном в старших возрастных группах и у лиц с ослабленным иммунитетом.Эти случаи потребуют дальнейшего расследования, чтобы собрать и проверить доказательства связи между вакциной и клиническим заболеванием, чтобы поддержать принятие решений относительно вакцинации против YF.

Кросби М. Американская чума: нерассказанная история желтой лихорадки, эпидемии, которая сформировала нашу историю. Беркли, Калифорния: Издательская группа Беркли; 2007.
Monath TP. Желтая лихорадка: Виктор, Виктория? Завоеватель, завоевание? Эпидемии и исследования за последние сорок лет и перспективы на будущее.Am J Trop Med Hyg 1991; 45 (1): 1-43.
Monath TP. Лечение желтой лихорадки. Antiviral Res 2008; 78 (1): 116-24.
Рейтер П. Изменение климата и болезни, передаваемые комарами. Environ Health Perspect 2001; 109 Дополнение 1: 141-61.
Reiter P, Nathan M. Руководство по оценке эффективности инсектицидных аэрозольных аэрозолей для борьбы с переносчиком денге, Aedes aegypti . Женева: Всемирная организация здравоохранения; 2001.