Повреждение слизистой: Поражения слизистой оболочки рта травматического происхождения

Продольное исследование повреждения слизистой оболочки пищевода после эзофагэктомии и введения желудка: взаимосвязь между повреждением слизистой оболочки, вызванным рефлюксом, и передачей сигналов Notch —

юаней Введение

Гастроэзофагеальное рефлюксное расстройство (ГЭРБ), состояние, при котором рефлюкс содержимого желудка вызывает симптомы рефлюкса или / или осложнения, является распространенным заболеванием во всем мире (1,2).ГЭРБ имеет клиническое значение из-за того, что она связана с хроническим повреждением пищевода и пищеводом Барретта, что предрасполагает к аденокарциноме пищевода. У пациентов с хроническим повреждением слизистой оболочки пищевода, вызванным гастроэзофагеальным рефлюксом, метаплазия Барретта развивается, когда столбчатые клетки замещают плоскоклеточные клетки пищевода. На сегодняшний день молекулярный патогенез этого процесса в значительной степени неизвестен. Современные гипотезы предполагают, что гастроэзофагеальный рефлюкс может изменять экспрессию некоторых ключевых факторов транскрипции, приводя к трансдифференцировке от зрелых плоскоклеточных клеток пищевода к зрелым столбчатым клеткам или индуцируя столбчатую дифференцировку незрелых клеток-предшественников пищевода (3-5).

Передача сигналов Notch, группа высококонсервативных трансмембранных гликопротеинов типа I, широко участвует в развитии, дифференцировке, пролиферации и апоптозе клеток. Обычно его считают одним из наиболее важных сигнальных путей для определения судьбы клетки (6-8). Некоторые исследования показали, что передача сигналов Notch играет критическую роль в дифференцировке клеток в сторону секреторных клеток, таких как бокаловидные клетки. Активная передача сигналов Notch может предохранять базальные клетки эпителия от дифференцировки, в то время как ингибирование сигналов Notch способствует продукции секреторных клеток (9,10). Эксперименты in vitro предоставили доказательства того, что ингибирование передачи сигналов Notch, индуцированное желчной кислотой, коррелировало с образованием пищевода Барретта (11,12). С помощью метода трехмерной органотипической культуры в исследовании сообщалось, что ингибирование передачи сигналов Notch может усиливать трансдифференцировку плоского эпителия пищевода в сторону метаплазии Барретта (13). Тем не менее, сигнальный путь Notch не исследовался на человеческой модели гастроэзофагеального рефлюкса. Для более точного понимания молекулярного патогенеза пищевода Барретта необходимо изучить передачу сигналов Notch на идеальной модели гастроэзофагеального рефлюкса человека.

Эзофагэктомия и эзофагогастростомия обычно показаны пациентам с операбельным раком пищевода. Многочисленные исследования доказали, что рефлюкс является частым осложнением после эзофагэктомии, а повреждение слизистой оболочки пищевода, вызванное рефлюксом, в конечном итоге развивается у большинства пациентов (14,15). Соответственно, эзофагэктомия и эзофагогастростомия создают хорошую модель гастроэзофагеального рефлюкса для изучения молекулярного патогенеза вызванного рефлюксом повреждения слизистой оболочки пищевода.В настоящем исследовании мы использовали эту модель для изучения роли передачи сигналов Notch в развитии повреждения слизистой оболочки пищевода, вызванного рефлюксом.

Методы

Исследуемая популяция и последующее наблюдение

С февраля 2011 г. по декабрь 2012 г. для этого проспективного исследования были отобраны пациенты, перенесшие эзофагэктомию с желудочным вмешательством.Эта работа была одобрена этическим комитетом больницы Западного Китая (WCh3010-56), и все пациенты получили информированное согласие. Все эксперименты проводились в соответствии с соответствующими инструкциями и правилами.

Чтобы обеспечить более длительный период наблюдения в этом продольном исследовании, мы включили пациентов с плоскоклеточной карциномой пищевода на ранней стадии (Союз по международному контролю рака, стадия рака пищевода TNM, 7-е издание, Tis или T1-2N0M0).Была выполнена стандартная эзофагэктомия Айвора-Льюиса без пилоропластики или пилоротомии, и внутригрудные анастомозы были наложены вручную методом сшивания с конфигурацией конец в бок. Мы включали только пациентов, у которых не было послеоперационных осложнений со стороны анастомоза (т. Е. Утечки и образования стриктуры). Пациенты с остаточной опухолью культи пищевода после операции или с рецидивом опухоли в течение периода наблюдения были исключены из этого исследования.

Во время операции были получены два кусочка нормальной слизистой оболочки пищевода из резецированного образца, один был мгновенно заморожен для полимеразной цепной реакции (ПЦР), а другой был зафиксирован в формалине для иммуногистохимии (ИГХ).Пациенты после эзофагэктомии обычно наблюдались каждые 3 месяца в течение первого года, каждые 6 месяцев в течение второго года, а затем ежегодно. Для этого исследования послеоперационные контрольные осмотры были запланированы через 6, 18, 36 и 48 месяцев. Были выполнены оценка симптомов рефлюкса, эндоскопическая оценка повреждения слизистой оболочки пищевода и забор биопсии. Ингибитор протонной помпы (ИПП) и прокинетики показаны пациентам со значительными симптомами рефлюкса или осложнениями.

Симптомы рефлюкса

Послеоперационные симптомы гастроэзофагеального рефлюкса включали дисфагию, срыгивание, изжогу и одинофагию.Также принимались во внимание некоторые другие симптомы, связанные с гастроэзофагеальным рефлюксом, такие как кашель, астма, аспирация и ларингит. Интенсивность рефлюкса оценивалась следующим образом: 0 — отсутствие рефлюкса в полулежачем положении; 1, постпрандиальный рефлюкс в полулежании; 2 — рефлюкс на пустой желудок в положении полулежа на спине; 3 — постпрандиальный рефлюкс в вертикальном положении; 4, рефлюкс натощак в вертикальном положении (16). Кроме того, регистрировались препараты (ППТ и / или прокинетики) для лечения рефлюкса.

Эндоскопическое обследование и гистология

Эндоскопические исследования остатка пищевода были выполнены всем пациентам с использованием системы Olympus. Описание повреждения слизистой оболочки, вызванного рефлюксом, основано на Armstrong et al. Система MUSE . Поражения были классифицированы на метаплазию (M), язву (U), стриктуру (S) и эрозию (E). Кроме того, степень тяжести каждого поражения оценивалась следующим образом: 0 — нет; 1, легкая; 2, тяжелая.Оценка 0 считалась отрицательной по MUSE, а оценка 1 или выше считалась положительной по MUSE (17). Местоположение анастомоза регистрировали как расстояние от резцов, а затем исследовали желудочный канал с записью свидетельств дуоденогастрального рефлюкса. Эндоскопический рефлюкс желчи регистрировался при наличии жидкости желчного цвета в полости желудка. Пищеводно-желудочный анастомоз легко увидеть как маркер нового желудочно-пищеводного перехода при эндоскопии. Четыре окружных биопсии были взяты с помощью обычных щипцов из предполагаемой области остатка пищевода или на расстоянии 2 см от места анастомоза, когда не было визуализировано никаких повреждений.Две биопсии были немедленно зафиксированы в формалине, а затем заключены в парафин для ИГХ или окрашивания гематоксилином и эозином, а другие были мгновенно заморожены жидким азотом и затем сохранены при -80 ° C для более поздней экстракции РНК и ПЦР. Гистологическая оценка слизистой оболочки остатка пищевода проводилась независимыми патологами на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином. Повреждение остатка пищевода, вызванное рефлюксом, рассматривалось с точки зрения идиопатической рефлюксной болезни, включая воспаление, разрывы слизистой оболочки (эрозию или изъязвление) и метаплазию с столбчатой ​​выстилкой (15).Гистологические интерпретации коррелировали с эндоскопической визуальной оценкой повреждения слизистой оболочки.

IHC

ИГХ проводили для обнаружения экспрессии белков с использованием фиксированного формалином, залитого парафином блока. Срезы депарафинизировали ксилолом и регидратировали с помощью последовательных промывок этанолом. Эндогенную пероксидазу блокировали инкубацией с 3% перекисью водорода. После извлечения антигена слайды инкубировали с первичными антителами ( Notch2 , Santa Cruz, разведение 1: 100; Hes1 , abcam, разведение 1: 200) с последующей инкубацией с биотинилированным вторичным антителом (Dako, разведение 1: 300). .Антитела были предварительно подтверждены вестерн-блоттингом. Связанные антитела выявляли авидин-биотин-пероксидазным методом и DAB. Наконец, предметные стекла контрастировали гематоксилином Харриса и закрывали покровными стеклами. Известные положительные контроли (нормальная кожная ткань) включали в каждый анализ, а отрицательные контроли делали, исключая первичные антитела. Результаты интерпретировали с использованием полуколичественной оценки по трехуровневой системе, где 0 означало отсутствие окрашивания; 1 обозначено минимальное и переменное окрашивание; 2 обозначало явное и интенсивное окрашивание.Положительным окрашиванием считались только срезы со степенью 2. Два независимых наблюдателя получили доступ к срезам для иммуногистохимического окрашивания; любые разногласия по поводу оценки разрешались путем обсуждения или разрешались другим лицом. Наблюдатели не знали о клинических характеристиках пациентов.

ПЦР в реальном времени

Суммарную РНК экстрагировали с использованием реагента Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) в соответствии с протоколом производителя.Количественный анализ и квалификация общей РНК определяли с помощью биоанализатора Agilent 2100 (Agilent, Уилмингтон, Делавэр, США) с использованием набора RNA 6000 Nano Assay Kit (Agilent, Wilmington, DE, USA). Комплементарную ДНК (кДНК) получали с использованием набора для обратной транскрипции QuantiTect (Qiagen, Hilden, Германия) в соответствии с инструкциями. Концентрацию и качество образцов кДНК измеряли с помощью спектрофотометра NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Уилмингтон, Делавэр, США). Для количественной ПЦР в реальном времени было выполнено серийное разведение каждого гена для построения стандартной кривой.Пять мкл кДНК (синтезированной из 1 мкг общей РНК) и 1 мкл праймеров (10 пмоль / мкл) смешивали с SYBR Green Master Mix с использованием набора QuantiTect SYBR Green PCR в конечном реакционном объеме 25 мкл. RT-PCR выполняли на Rotor Gene 3000, каждый анализ проводили в трех экземплярах, и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу человека ( GAPDH ) использовали в качестве контрольного гена. Последовательности и размер ампликонов для праймеров перечислены в таблице . Продукты ПЦР были подтверждены анализом кривой плавления и электрофорезом в агарозном геле.Относительная количественная оценка экспрессии была рассчитана методом двойной стандартной кривой, и соотношение целевого гена выражено в образце по сравнению с контролем по сравнению с контрольным геном ( GAPDH ) (18).

Статистический анализ

Качественные данные были представлены в виде частот и процентов, непрерывные данные были описаны как медиана с межквартильным размахом.Односторонний дисперсионный анализ и парный тест t использовали для сравнения различий в уровнях мРНК в разные моменты времени. Уровни мРНК в разных гистологических группах сравнивали с помощью теста Краскела – Уоллиса. Для сравнения порядковых данных (оценка рефлюкса) использовался тест Фридмана. Для анализа категориальных данных использовался критерий хи-квадрат. Корреляционный анализ был выполнен между уровнями экспрессии Notch2 и Hes1 с коэффициентом корреляции Пирсона. Разницу считали статистически значимой, когда значение P <0.05. Для учета эффекта множественного тестирования использовалась поправка Бонферрони для корректировки порогового значения P для значимости множественных сравнений. При сравнении пяти различных временных точек считалось, что значения P ниже 0,005 указывают на статистическую значимость. Статистический анализ проводился с использованием SPSS Statistics версии 19.0 (SPSS IBM Inc., Чикаго, Иллинойс, США).

Результаты

Пациенты

48 пациентов, перенесших эзофагэктомию Айвора-Льюиса по поводу плоскоклеточного рака пищевода, первоначально были включены в это проспективное продольное исследование.В течение периода исследования 3 пациента были исключены из исследования из-за рецидива опухоли, а 1 пациент был потерян для последующего наблюдения, то есть 44 из 48 пациентов (92%) завершили 4-летнее наблюдение. Характеристики пациентов и клинические данные сведены в Таблица 2 . Предоперационная диагностика и клиническая стадия были достигнуты с помощью эндоскопии верхних отделов желудочно-кишечного тракта с биопсией и компьютерной томографии с контрастным усилением. У всех пациентов не было в анамнезе гастроэзофагеальной рефлюксной болезни или эндоскопических доказательств связанного с рефлюксом повреждения слизистой оболочки пищевода до операции.Они не получали периоперационную адъювантную терапию по поводу рака пищевода, а послеоперационная патологическая стадия была проведена в соответствии с рекомендациями 7-го издания TNM стадирования рака пищевода. Периоперационных смертей не было, пациенты наблюдались более 4 лет. Симптомы рефлюкса и эндоскопически визуализированное повреждение слизистой оболочки остаточного пищевода, связанное с рефлюксом, оценивали при каждом последующем наблюдении. Между тем были взяты биопсии для гистологического исследования, анализов ИГХ и ПЦР.

Оценка симптомов рефлюкса

Рефлюкс был частым осложнением у пациентов после эзофагэктомии с интервалом желудка, а срыгивание было наиболее частым симптомом послеоперационного рефлюкса (, таблица 3, ).Симптомы, связанные с гастроэзофагеальным рефлюксом, наблюдались у 86% пациентов через 6 месяцев, 73% пациентов через 18 месяцев, 80% пациентов через 36 месяцев и 75% пациентов через 48 месяцев после операции. баллов (P = 0,274). Что касается оценки интенсивности рефлюкса, статистической разницы в четырех последующих наблюдениях обнаружить не удалось (P = 0,191). Однако количество пациентов, получавших лекарства от рефлюкса, уменьшалось со временем непрерывно после операции, и разница достигла статистической значимости (P <0.001).

Эндоскопия

Эндоскопическая оценка и биопсия выполнялись при каждом последующем осмотре, а также 176 эндоскопических исследований. Описание повреждения слизистой оболочки, вызванного рефлюксом, основано на Armstrong et al. Система MUSE (17). Эндоскопические данные описаны в Таблица 3 . Изображения были сделаны для подтверждения повреждения слизистой оболочки остатка пищевода ( Рисунок 1 ).Анастомоз был измерен на расстоянии 22,5 ± 3,6 см от резцов в этой когорте. Связанные с рефлюксом повреждения остатка пищевода визуализировались эндоскопически (положительный результат MUSE) чаще при последующих наблюдениях, а частота положительных результатов MUSE увеличилась с 57% через 6 месяцев до 89% через 48 месяцев (P = 0,002). Эрозия представляла собой наиболее частое визуализированное повреждение остатка пищевода, которое было зарегистрировано в 75 из 176 обследований (43%). Примечательно, что рефлюкс желчи был обычным явлением для пациентов после эзофагэктомии и эзофагогастростомии (27%, 32%, 23% и 34% в течение 6, 18, 36 и 48 месяцев соответственно), в то время как существенных различий не было. среди различных наблюдений (P = 0.663).

Рисунок 1 Эндоскопические изображения остатка пищевода после операции. (А) Нормальная слизистая оболочка; (B) тяжелая язва и эрозии; (C) столбчатая метаплазия.

Гистологическое исследование

Гистологическая оценка остатка пищевода показала, что повреждение, связанное с рефлюксом, значительно увеличилось с 27% пациентов через 6 месяцев до 89% через 48 месяцев после операции (P <0.001), что соответствовало тенденции эндоскопически визуализированных повреждений. Из 176 биопсий, взятых для гистологической оценки, 63 (36%) образцов не показали никаких отклонений. Из оставшихся 113 образцов 98 (56%) представляли эзофагит (воспаление или разрывы слизистой оболочки), а 15 (9%) - метаплазию. В течение периода исследования наблюдалось увеличение распространенности столбчатой ​​метаплазии. Первоначальное выявление столбчатой ​​метаплазии было сделано через 18 месяцев (5%), а процент метаплазии увеличился до 14% через 36 месяцев и 16% через 48 месяцев.Ни одна из столбчатых метаплазий не прогрессировала до дисплазии в течение периода исследования. Не было обнаружено корреляций между симптомами рефлюкса и задокументированным повреждением слизистой оболочки, включая эндоскопические или гистологические доказательства (P> 0,05).

Экспрессии мРНК Notch2 и Hes1

Относительные уровни экспрессии мРНК Notch2 и Hes1 в образцах пищевода в разные моменты времени показаны на Фигуре 2 .Все биопсии, включая нормальный пищевод, эзофагит и метаплазию, были включены для каждой временной точки наблюдения. Результаты показали, что экспрессия Notch2 снижалась в зависимости от времени после операции, и разница достигла статистической значимости (P <0,001). Мы также применили попарные сравнения к пяти различным группам, демонстрируя тенденцию к снижению от «операции» до «6 месяцев», от «6 месяцев» до «18 месяцев», от «18 месяцев» до «36 месяцев» (P < 0.001), но не от «36 месяцев» до «48 месяцев» (P = 0,068). При сравнении уровней экспрессии мРНК Notch2 в образцах с эндоскопическими доказательствами повреждения слизистой оболочки и без них, положительные образцы MUSE продемонстрировали более низкую экспрессию по сравнению с отрицательными биопсиями MUSE (P = 0,035). Что касается экспрессии мРНК Notch2 в слизистой оболочке пищевода с различными гистологическими изменениями, значительные различия были обнаружены среди нормальной плоской слизистой оболочки, эзофагита и метаплазии (P <0.001) ( Рисунок 3A ). Образцы нормального плоского эпителия показали значительно более высокую экспрессию мРНК Notch2 по сравнению с эзофагитом (P = 0,036), а экспрессия мРНК Notch2 также была выше при эзофагите, чем при метаплазии (P = 0,004).

Рисунок 2 Относительная экспрессия мРНК Notch2 и Hes1 в разные моменты времени. Все биопсии, включая нормальный пищевод, эзофагит и метаплазию, были включены для каждой временной точки наблюдения.Уровни экспрессии показаны в виде прямоугольных диаграмм, иллюстрирующих диапазон (планки ошибок), квартили (прямоугольник), медианное значение (выделено жирной линией). Уровни экспрессии мРНК Notch2 (A) и Hes1 (B) были снижены в зависимости от времени после операции (P <0,001).

Фигура 3 Относительная экспрессия мРНК Notch2 и Hes1 в слизистой оболочке пищевода с различными гистологическими изменениями.Каждое гистологическое изменение включало биопсию из разных временных точек. Уровни экспрессии показаны в виде прямоугольных диаграмм, иллюстрирующих диапазон (планки ошибок), квартили (прямоугольник), медианное значение (выделено жирной линией). Значительные различия были обнаружены в значениях экспрессии мРНК Notch2 (A) и Hes1 (B) среди нормальной плоской слизистой оболочки, эзофагита и метаплазии (P <0,001).

Hes1 представляет собой хорошо охарактеризованный нижестоящий ген-мишень для передачи сигналов Notch.Таким образом, мы также исследовали экспрессию мРНК Hes1 в образцах биопсии. Оказалось, что уровень мРНК Hes1 снижался в зависимости от времени. Уровни экспрессии Notch2 и Hes1 в пяти временных точках хорошо коррелировали друг с другом (P <0,001). Коэффициенты корреляции Пирсона для пяти временных точек составили 0,582, 0,740, 0,924, 0,797 и 0,912 соответственно. Сравнение между разными группами также показало тенденцию к снижению от «операции» до «6 месяцев» (P = 0.003), от «6 месяцев» до «18 месяцев» (P <0,001), от «18 месяцев» до «36 месяцев» (P <0,001), но не от «36 месяцев» до «48 месяцев» (P = 0,324). Образцы с эндоскопическими доказательствами повреждения слизистой оболочки (MUSE-положительные) продемонстрировали более низкий уровень экспрессии мРНК Hes1 по сравнению с биопсиями с нормальными эндоскопическими данными (MUSE-отрицательными) (P = 0,017). Уровни экспрессии Hes1 для нормального плоского эпителия, эзофагита и столбчатой ​​метаплазии показаны на Фигуре 3B .Разница между тремя гистологическими группами была статистически значимой (P <0,001). Гистологически нормальный плоский эпителий демонстрировал более высокую экспрессию мРНК Hes1 по сравнению с гистологически подтвержденным эзофагитом (P <0,001), а значительно более низкая экспрессия мРНК Hes1 была обнаружена при метаплазии по сравнению с эзофагитом (P = 0,013). Однако не наблюдалось значительных различий в экспрессии мРНК Notch2 или Hes1 между образцами с эндоскопически очевидным рефлюксом желчи и без него (P> 0.05). Чтобы оценить возможность того, что изменения в Notch2 / Hes1 были следствием степени рефлюксного повреждения и не зависели от времени, мы сравнили экспрессию Notch2 / Hes1 для каждого гистологического изменения, включая нормальный пищевод, эзофагит и метаплазию, в разные моменты времени. Оказалось, что достоверных различий между разными временными точками не было (P> 0,05).

Иммуногистохимическое исследование Notch2 и Hes1

IHC был также выполнен для исследования экспрессии Notch2 и Hes1 в образцах хирургической и послеоперационной эндоскопической биопсии. Notch2 Экспрессия обычно локализовалась в клеточной мембране и цитоплазме эпителиальных клеток пищевода ( фиг. 4, ), а экспрессия Hes1 была обнаружена в цитоплазме и ядре ( фиг. 5, ). Положительные окрашивания Notch2 и Hes1 чаще наблюдались в срезах хирургических образцов по сравнению с образцами послеоперационных биопсий. Когда мы сравнивали срезы в разные моменты времени после эзофагэктомии, наблюдалась тенденция к снижению экспрессии Notch2 (P <0.001) и Hes1 (P = 0,003) окрашивание слизистой оболочки пищевода при длительном послеоперационном рефлюксе ( Рисунок 6, ). Что касается образцов с различными гистологическими изменениями, как Notch2 , так и Hes1 показали снижающийся паттерн экспрессии от нормальной слизистой оболочки до эзофагита и метаплазии, различия между группами достигли статистической значимости (P <0,001). Тем не менее, не было обнаружено значительных различий в экспрессии белков Notch2 или Hes1 для следующих сравнений: MUSE-положительные и MUSE-отрицательные образцы, образцы с симптомом рефлюкса и без него, биопсии с признаками рефлюкса желчи и без них (P> 0.05).

Рисунок 4 Репрезентативное иммуногистохимическое окрашивание Notch2 в образцах с различными гистологическими изменениями. Масштаб на рисунке 40 мкм. Увеличенное изображение показано в правом верхнем углу. Коричневое окрашивание клеток указывает на положительное окрашивание, а отсутствие коричневого окрашивания указывает на отрицательное окрашивание. (A) Белок Notch2 в нормальном пищеводе: Notch2 экспрессируется в клеточной мембране и цитоплазме эпителиальных клеток пищевода, интенсивное окрашивание Notch2 в основном присутствует в базальном слое клеток; (B) Экспрессия Notch2 при эзофагите: слабое окрашивание в слое базальных клеток; (C) Экспрессия Notch2 в метаплазии: окрашивание Notch2 отрицательно в столбчатых клетках.

Рисунок 5 Репрезентативное иммуногистохимическое окрашивание Hes1 в образцах с различными гистологическими изменениями. Масштаб на рисунке 40 мкм. Увеличенное изображение показано в правом верхнем углу. Коричневое окрашивание клеток указывает на положительное окрашивание, а отсутствие коричневого окрашивания указывает на отрицательное окрашивание. (A) Экспрессия Hes1 в нормальной слизистой оболочке: сильная иммунореактивность присутствует в цитоплазме и ядре; (B) Экспрессия Hes1 при эзофагите: слабое окрашивание в слое базальных клеток; (C) Экспрессия Hes1 при метаплазии: окрашивание Hes1 отрицательно в столбчатых клетках.

Фигура 6 Полуколичественное определение иммунореактивности для Notch2 и Hes1. Случаи положительной иммунореактивности (определяемые как 2 балла по шкале от 0 до 2) по отношению к общему количеству образцов рассчитывались в процентах. Экспрессия Notch2 (A) и Hes1 (B) снижалась в зависимости от времени.

Обсуждение

Интерпозиция желудка остается предпочтительным способом реконструкции пищеварительной системы после эзофагэктомии.Независимо от подходов, используемых для реконструкции пищевода, эзофагэктомия с желудочным вмешательством разрушает большинство защитных механизмов против рефлюкса, создавая сообщающуюся полость между желудком и пищеводом. Гастроэзофагеальный рефлюкс — частое осложнение после эзофагэктомии и эзофагогастростомии, которое в конечном итоге может привести к повреждению остатка пищевода. В нескольких исследованиях сообщалось, что эзофагэктомия с подтягиванием желудка увеличивает развитие эзофагита, а также эпителия Барретта (19-21).Следовательно, эзофагэктомия с введением желудка может представлять собой хорошую модель in vivo для патогенеза ГЭРБ. Насколько нам известно, это первый отчет, в котором проспективно исследуется передача сигналов Notch в человеческой модели гастроэзофагеального рефлюкса в течение длительного периода времени.

В нашем исследовании эзофагэктомия с внутригрудной эзофагогастростомией была показана пациентам с плоскоклеточной карциномой на ранней стадии без какой-либо химиотерапии или лучевой терапии, что важно для исследования молекулярного патогенеза повреждения слизистой оболочки, связанного с рефлюксом, in vivo модель .В течение длительного периода наблюдения в течение 4 лет большинство пациентов жаловались на выраженные симптомы рефлюкса, и у большинства этих пациентов были обнаружены эндоскопические или гистологические доказательства повреждения слизистой оболочки. Мы показали, что повреждение слизистой оболочки чаще наблюдалось при более длительном наблюдении при эндоскопической или гистологической оценке. Однако мы не обнаружили корреляции между симптомами рефлюкса и эндоскопически визуализированными повреждениями или гистологическими результатами. Симптоматическая оценка гастроэзофагеального рефлюкса имеет серьезные ограничения; эндоскопия и биопсия — более надежные методы оценки остатка пищевода после эзофагогастростомии.В некоторых сообщениях даже считается, что симптомы рефлюкса на самом деле не имеют значения для прогнозирования наличия связанного с рефлюксом повреждения в остатке пищевода (15,22). Примечательно, что у 16% пациентов в нашем продольном исследовании развилась метаплазия в остаточном пищеводе, распространенность была намного меньше, чем в западных странах (20,23). Ранее мы исследовали разницу в повреждении слизистой оболочки остатка пищевода после эзофагэктомии и желудочного вмешательства между китайской и канадской популяциями, обнаружив, что канадская популяция была более чувствительна к поражению гастроэзофагеальным рефлюксом по сравнению с китайской популяцией, что может быть связано с различным генетическим фоном ( 24).

Исследования in vitro показывают, что ингибирование передачи сигналов Notch может способствовать трансдифференцировке плоского эпителия пищевода в сторону метаплазии, подобной метаплазии Барретта (11,13). Более того, в модели на крысах ингибирование передачи сигналов Notch ингибиторами гамма-секретазы приводило к метаплазии бокаловидных клеток кишечника (25). В нашем исследовании экспрессия мРНК Notch2 в плоскоклеточном эпителии, подверженном рефлюксу, снижалась зависимым от времени образом после эзофагэктомии и эзофагогастростомии, и экспрессия Hes1 , как нижележащий ген-мишень передачи сигналов Notch, демонстрировала тот же паттерн.Иммуногистохимические исследования также подтвердили, что экспрессия Notch2 и Hes1 подавлялась аналогичным образом после эзофагэктомии. Учитывая, что гастроэзофагеальный рефлюкс может развиваться почти у всех пациентов после эзофагэктомии с желудочным вставлением, наше продольное исследование на человеческой модели показало, что рефлюкс в остаток пищевода может ингибировать сигнальный путь Notch.

Это исследование in vivo также предоставило доказательства, подтверждающие, что сигнальный путь Notch может играть важную роль в процессе повреждения слизистой оболочки после гастроэзофагеального рефлюкса.На большой части слизистой оболочки пищевода рядом с областью анастомоза после операции была обнаружена некоторая степень эндоскопически визуализированного или гистологически подтвержденного повреждения. От нормального плоского эпителия до рефлюкс-эзофагита и метаплазии уровни экспрессии Notch2 постепенно снижались при прогрессировании гистологических изменений, вызванных рефлюксом, особенно при наличии метаплазии. В качестве нижестоящего гена-мишени передачи сигналов Notch, Hes1 следует той же тенденции, подтверждая, что передача сигналов Notch участвует в патогенезе связанных с рефлюксом повреждений слизистой оболочки.

Кроме того, сравнивали уровни экспрессии Notch в образцах с эндоскопически визуализированным повреждением и без него. MUSE-положительные образцы продемонстрировали более низкую экспрессию мРНК Notch по сравнению с MUSE-отрицательными биопсиями. Мы ожидали увидеть меньшую экспрессию белка Notch по оценке IHC для MUSE-положительных образцов. Однако между группами не было обнаружено значительных различий. Мы также отметили, что не было значительной корреляции между результатами эндоскопии и гистологическими доказательствами повреждения слизистой оболочки, демонстрируя, что результаты эндоскопии не могут действительно отражать фактическую тяжесть повреждения слизистой оболочки, вызванного рефлюксом.В нашем исследовании четыре биопсии были взяты с помощью обычных щипцов; два для HE и IHC и два для ПЦР. Помимо ошибки выборки, другим возможным объяснением расхождения между гистологией и эндоскопией может быть наличие неэрозивной рефлюксной болезни. Наши наблюдения сопоставимы с результатами других отчетов (15). Это также может объяснить, почему разница в экспрессии белка Notch между MUSE-положительными и MUSE-отрицательными группами не достигла статистической значимости. Кроме того, мы также обнаружили, что распространенность повреждения из-за рефлюкса (MUSE или гистология), как правило, была выше во все моменты времени, чем распространенность потери IHC Notch2 / Hes1 , была вероятность того, что потеря передачи сигналов Notch не была драйвером метаплазии. но было просто следствием.Требуются дополнительные исследования, чтобы прояснить этот вопрос.

Известно, что желчные кислоты играют важную роль в развитии пищевода Барретта (26), и мы исследовали их влияние на экспрессию Notch. Отчет Tamagama et al. показал, что стимуляция желчной кислотой в клеточных линиях пищевода подавляет сигнальный путь Notch (11). Одна из наших первоначальных целей состояла в том, чтобы проверить представление о том, что пациенты без желчного рефлюкса имели более высокую экспрессию передачи сигналов Notch.Тем не менее, рефлюкс желчи был обнаружен в 51 из 176 эндоскопических исследований, и нам не удалось обнаружить влияние рефлюкса желчи на развитие повреждения слизистой оболочки или экспрессию передачи сигналов Notch. В нашем центре у пациентов после эзофагэктомии обычно не проводилось исследование желчных кислот, гепатобилиарная сцинтиграфия или рН-манометрия, а рефлюкс оценивался исключительно с помощью эндоскопии. Однако известно, что эндоскопия имеет ограниченную чувствительность и специфичность диагностики рефлюкса желчи (27), что может объяснить, почему мы не увидели взаимосвязи между рефлюксом желчи и повреждением слизистой оболочки или экспрессией Notch.Другим ограничением этого исследования было то, что мы не могли подтвердить гистологический подтип для биопсии с мгновенным замораживанием, используемой для экспрессии генов, из-за очень маленького размера каждого образца биопсии. Чтобы свести к минимуму эту ошибку отбора проб, были взяты периферические биопсии из предполагаемой области остатка пищевода или на расстоянии 2 см от места анастомоза, когда не было визуализированных повреждений. На основании образцов, использованных для окрашивания HE или IHC, казалось, что они имеют хорошее соответствие гистологическому подтипу.Кроме того, некоторые пациенты в этом исследовании получали медикаментозную терапию для контроля симптомов рефлюкса. ИПП и прокинетики показаны пациентам со значительными симптомами рефлюкса или его осложнениями. Однако мы обнаружили, что использование лекарств снизилось, несмотря на продолжающиеся симптомы и ухудшение эндоскопических признаков повреждения. Оказалось, что симптомы рефлюкса более переносимы у пациентов с более длительным послеоперационным периодом. Семнадцать пациентов получали антирефлюксные препараты через 48 месяцев, и у 16 ​​(94%) из них были гистологические доказательства травмы; в то время как 23 (85%) из 27 пациентов без антирефлюксной терапии имели гистологически подтвержденное повреждение.Разница не достигла статистической значимости (P = 0,63). Медикаментозная терапия у некоторых пациентов не была ни регулярной, ни продолжительной из-за низкого уровня комплаентности, что делало непрактичным сопоставление ее с оценкой экспрессии сигналов Notch. До сих пор неясно, может ли использование лекарств изменить экспрессию передачи сигналов Notch в слизистой оболочке пищевода после желудочного вмешательства. Дальнейшие исследования молекулярной биологии должны прояснить этот вопрос.

Выводы

В заключение, связанное с рефлюксом повреждение слизистой оболочки пищевода является частым осложнением у пациентов, перенесших эзофагэктомию и вставку желудка.Используя эту модель рефлюкса человека, наше продолжительное последующее исследование показало, что гастроэзофагеальный рефлюкс может подавлять путь передачи сигналов Notch в слизистой оболочке пищевода, а передача сигналов Notch может играть потенциальную роль в развитии повреждения слизистой оболочки после гастроэзофагеального рефлюкса. Требуются дополнительные функциональные исследования, чтобы проверить наши предварительные выводы. Будущие исследования с использованием модели in vivo гастроэзофагеального рефлюкса внесут вклад в изучение роли ключевых сигнальных путей в патогенезе пищевода Барретта.

Благодарности

Авторы очень благодарны доктору Андре Дюрансо (Госпитальный центр Университета Монреаля, Квебек, Канада) за его экспертные советы по исследованию.

Финансирование : Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (номер гранта 81500419, 30770982).

Конфликты интересов : это исследование было принято для устной презентации на 24-м ежегодном собрании ESTS (Неаполь, Италия, 2016 г.), и ему был предоставлен грант ESTS-DGT Travel.Он также был устно представлен на 15-м Всемирном конгрессе Международного общества болезней пищевода (ISDE) (Сингапур, сентябрь 2016 г.).

Этическое заявление : Это исследование было одобрено этическим комитетом больницы Западного Китая (WCh3010-56), и от всех пациентов было получено информированное согласие. Все эксперименты проводились в соответствии с соответствующими инструкциями и правилами.

Список литературы

1. Vakil N, van Zanten SV, Kahrilas P, et al.Монреальское определение и классификация гастроэзофагеальной рефлюксной болезни: глобальный консенсус, основанный на фактических данных. Am J Gastroenterol 2006; 101: 1900-20. [Crossref] [PubMed]
2. Spechler SJ, Соуза РФ. Пищевод Барретта. N Engl J Med 2014; 371: 836-45. [Crossref] [PubMed]
3. Croagh D, Thomas RJ, Phillips WA и др. Стволовые клетки пищевода — обзор их идентификации и характеристики. Стволовые клетки Ред. 2008; 4: 261-8. [Crossref] [PubMed]
4. Quante M, Abrams JA, Lee Y и др.Пищевод Барретта: что модель на мышах может научить нас о болезнях человека. Клеточный цикл 2012; 11: 4328-38. [Crossref] [PubMed]
5. Stamp LA, Braxton DR, Wu J, et al. Эпитоп GCTM-5, связанный с муциноподобным гликопротеином FCGBP, маркирует клетки-предшественники в тканях энтодермального происхождения. Стволовые клетки 2012; 30: 1999-2009. [Crossref] [PubMed]
6. Fre S, Huyghe M, Mourikis P и др. Сигналы Notch контролируют судьбу незрелых клеток-предшественников в кишечнике.Природа 2005; 435: 964-8. [Crossref] [PubMed]
7. Рамасами С.К., Кусумбе А.П., Ван Л. и др. Активность эндотелиального Notch способствует ангиогенезу и остеогенезу в кости. Природа 2014; 507: 376-80. [Crossref] [PubMed]
8. Lobry C, Oh P, Mansour MR, et al. Передача сигналов Notch: переключение онкогена на супрессор опухоли. Кровь 2014; 123: 2451-9. [Crossref] [PubMed]
9. Като М. Передача сигналов Notch в желудочно-кишечном тракте Int J Oncol 2007; 30: 247-51.(рассмотрение). [PubMed]
10. Wong GT, Manfra D, Poulet FM и др. Хроническое лечение ингибитором гамма-секретазы LY-411,575 подавляет продукцию бета-амилоидного пептида и изменяет лимфопоэз и дифференцировку кишечных клеток. J Biol Chem 2004; 279: 12876-82. [Crossref] [PubMed]
11. Tamagawa Y, Ishimura N, Uno G, et al. Сигнальный путь Notch и экспрессия CDX2 в развитии пищевода Барретта. Lab Invest 2012; 92: 896-909. [Crossref] [PubMed]
12. Morrow DJ, Avissar NE, Toia L, et al.Патогенез пищевода Барретта: желчные кислоты ингибируют сигнальный путь Notch с индукцией экспрессии гена CDX2 в клетках пищевода человека. Хирургия 2009; 146: 714-21; обсуждение 721-2. [Crossref] [PubMed]
13. Вега М.Э., Жиру В., Нацуизака М. и др. Ингибирование передачи сигналов Notch усиливает трансдифференцировку плоского эпителия пищевода в сторону метаплазии, подобной метаплазии Барретта, посредством KLF4. Клеточный цикл 2014; 13: 3857-66. [Crossref] [PubMed]
14. Lord RV, Wickramasinghe K, Johansson JJ, et al.Слизистая оболочка сердца в остатке пищевода после эзофагэктомии представляет собой приобретенный эпителий с чертами Барретта. Хирургия 2004; 136: 633-40. [Crossref] [PubMed]
15. D’Journo XB, Мартин Дж., Ракович Г. и др. Повреждение слизистой оболочки в остатке пищевода после эзофагэктомии и транспозиции желудка. Энн Сург 2009; 249: 262-8. [Crossref] [PubMed]
16. Wang WP, Gao Q, Wang KN, et al. Проспективное рандомизированное контролируемое исследование полумеханической эзофагогастростомии с ручной или циркулярной скобкой для предотвращения стриктуры анастомоза.Мировой журнал J Surg 2013; 37: 1043-50. [Crossref] [PubMed]
17. Армстронг Д., Беннетт Дж. Р., Блюм А. Л. и др. Эндоскопическая оценка эзофагита: отчет о проделанной работе по соглашению наблюдателя. Гастроэнтерология 1996; 111: 85-92. [Crossref] [PubMed]
18. Бустин С.А. Количественная оценка мРНК с использованием ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (ОТ-ПЦР): тенденции и проблемы. J Mol Endocrinol 2002; 29: 23-39. [Crossref] [PubMed]
19. Дреснер С.М., Гриффин С.М., Уэйман Дж. И др.Человеческая модель дуоденогастроэзофагеального рефлюкса в развитии метаплазии Барретта. Br J Surg 2003; 90: 1120-8. [Crossref] [PubMed]
20. О’Риордан Дж. М., Такер О. Н., Бирн П. Дж. И др. Факторы, влияющие на развитие эпителия Барретта при постезофагэктомии остатка пищевода. Am J Gastroenterol 2004; 99: 205-11. [Crossref] [PubMed]
21. da Rocha JR, Ribeiro U Jr, Sallum RA и др. Пищевод Барретта (BE) и карцинома культи пищевода (ES) после эзофагэктомии с подтягиванием желудка у пациентов с ахалазией: исследование, основанное на 10-летнем наблюдении.Энн Сург Онкол 2008; 15: 2903-9. [Crossref] [PubMed]
22. Джонс Э.Л., Меара М.П., ​​Шварц Дж.С. и др. Симптомы гастроэзофагеального рефлюкса не коррелируют с объективным pH-тестом после пероральной эндоскопической миотомии. Surg Endosc 2016; 30: 947-52. [Crossref] [PubMed]
23. D’Journo XB, Мартин Дж., Ферраро П. и др. Остаток пищевода после вставки желудка. Dis Esophagus 2008; 21: 377-88. [Crossref] [PubMed]
24. Yuan Y, Duranceau A, Chen L, et al.Сравнение повреждения слизистой оболочки из-за рефлюкса в остаточном пищеводе после эзофагэктомии и вставки желудка между китайским и канадским населением. Чжунхуа Вэй Чанг Вай Кэ За Чжи 2015; 18: 871-4. [PubMed]
25. Milano J, McKay J, Dagenais C и др. Модуляция обработки notch ингибиторами гамма-секретазы вызывает метаплазию бокаловидных клеток кишечника и индукцию генов, которые, как известно, определяют дифференцировку секреторных клонов кишечника. Toxicol Sci 2004; 82: 341-58. [Crossref] [PubMed]
26. Tamagawa Y, Ishimura N, Uno G, et al.Желчные кислоты индуцируют экспрессию Delta-like 1 через Cdx2-зависимый путь развития пищевода Барретта. Lab Invest 2016; 96: 325-37. [Crossref] [PubMed]
27. Chen TF, Yadav PK, Wu RJ, et al. Сравнительная оценка внутрижелудочных желчных кислот и гепатобилиарной сцинтиграфии в диагностике дуоденогастрального рефлюкса. Мировой журнал J Gastroenterol 2013; 19: 2187-96. [Crossref] [PubMed]

Цитируйте эту статью как: Yuan Y, Tong TJ, Zeng XX, Yang YS, Wang ZQ, Wang YC, Gou JH, Chen LQ.Продольное исследование повреждения слизистой оболочки пищевода после эзофагэктомии и желудочного вмешательства: взаимосвязь между повреждением слизистой оболочки, связанным с рефлюксом, и передачей сигналов Notch. J Thorac Dis 2017; 9 (12): 5249-5260. DOI: 10.21037 / jtd.2017.11.16

Заболевания слизистой оболочки полости рта | Отделение дерматологии

Заболевания слизистой оболочки полости рта могут вызывать болезненные проблемы со ртом. Вам может быть трудно есть, пить или даже разговаривать. Но в UC Davis Dermatology находится одна из единственных в стране специализированных клиник, специализирующихся исключительно на заболеваниях слизистой оболочки полости рта.У нас есть опыт, чтобы помочь вам, чтобы вы снова могли наслаждаться радостями жизни.

Что такое заболевание слизистой оболочки полости рта?

Слизистая оболочка полости рта — это слизистая оболочка или «кожа» внутри рта, включая щеки и губы. У людей с заболеваниями слизистой оболочки полости рта на этой подкладке могут появиться болезненные язвы или язвы во рту.

Заболевания слизистых оболочек могут поражать любую слизистую оболочку. Эти оболочки также находятся внутри носовых ходов, глаз, половых органов и пищеварительного тракта.

Что вызывает заболевание слизистой оболочки полости рта?

Заболевания слизистой оболочки полости рта могут иметь аутоиммунную связь, то есть иммунная система организма атакует здоровые клетки.Некоторые заболевания слизистой оболочки передаются по наследству.

Почему стоит выбрать UC Davis для лечения заболеваний слизистой оболочки полости рта

Наша клиника по лечению заболеваний слизистой оболочки полости рта предлагает услуги высочайшего уровня на Западном побережье. Вы получаете выгоду от:

• Эксклюзивный опыт: Директор клиники Насим Фазель, доктор медицины, доктор медицинских наук, имеет сертификаты дерматологии и стоматологии. Очень немногие специалисты по заболеваниям слизистой оболочки полости рта в США прошли такое тщательное обучение. Благодаря двойному диплому доктор Фазель специализируется на лечении различных заболеваний слизистой оболочки полости рта.Люди по всей стране приезжают в Калифорнийский университет в Дэвисе в поисках известной помощи и опыта доктора Фазеля.
• Элитная клиника: Наша клиника — единственная на Западном побережье, которой управляет врач, который одновременно является дерматологом и стоматологом. В стране есть лишь несколько клиник по лечению слизистой оболочки полости рта, которые имеют это отличие. Мы заботимся исключительно о людях с заболеваниями слизистой оболочки полости рта.
• Последние процедуры: Мы активно участвуем в дерматологических исследованиях и клинических испытаниях, чтобы найти новые методы лечения заболеваний слизистой оболочки полости рта.Доктор Фазель широко известна своими исследованиями красного плоского лишая полости рта и болезни Бехчета. Она также уделяет особое внимание использованию новых методов лечения стволовыми клетками.
• Уход за людьми любого возраста: Заболевания слизистой оболочки полости рта поражают детей и взрослых. Мы обеспечиваем комплексный уход для всех возрастов.

Наши партнеры по заболеванию слизистых оболочек

Заболевания слизистой оболочки могут поражать разные части тела. Мы сотрудничаем с другими специалистами UC Davis для оказания комплексной помощи. В зависимости от вашей уникальной ситуации вы также можете обратиться к специалистам по телефонам:

Заболевания слизистой оболочки полости рта, которые мы лечим

Ваш врач составляет индивидуальный план лечения в зависимости от типа заболевания и симптомов.Мы лечим все типы заболеваний слизистой оболочки полости рта, в том числе:

Болезнь Бехчета

Доктор Фазель получила национальное признание за свои исследования болезни Бехчета (иногда называемой синдромом Бехчета). Это редкое заболевание вызывает воспаление кровеносных сосудов по всему телу и может вызвать боль в суставах.

У людей с болезнью Бехчета появляются болезненные язвы на губах, языке, щеках, нёбе, горле и миндалинах. Язвы также часто возникают на гениталиях, глазах и коже. Хотя причина неизвестна, состояние может быть унаследовано или спровоцировано аутоиммунным заболеванием.

В дополнение к клиническим испытаниям терапии, лечение включает:

• Ополаскиватель для рта по рецепту для облегчения боли и дискомфорта
• Кортикостероиды для местного или перорального применения для облегчения воспаления
• Иммунодепрессанты, помогающие контролировать иммунную систему и снимать воспаление
• Селективные ингибиторы фосфодиэстеразы 4 (ФДЭ4) (Отезла®) для лечения язв в полости рта

Синдром жжения во рту

Это состояние вызывает болезненное жжение, покалывание или покалывание во рту.Симптомы чаще всего поражают язык и губы. Проблема не вызывает волдырей, но может повлиять на вкус.

Синдром жжения во рту чаще встречается у пожилых женщин. Возможные причины включают:

• Анемия
• Хроническая сухость во рту
• Диабет
• Лекарства
• Недостаточность витаминов и других пищевых продуктов

Вам будет оказана специализированная помощь по поводу этого болезненного расстройства, которое может быть сложно лечить. Поскольку это заболевание влияет на всех по-разному, мы составляем план лечения специально для вас.Процедуры могут включать:

• Изменение образа жизни (изменение диеты или приема лекарств)
• Обезболивающие для перорального и местного применения
• Витаминные добавки
• Заменители и стимуляторы слюны
• Лекарства, такие как бензодиазепины, трициклические антидепрессанты и габапентин

Красный плоский лишай полости рта

Это хроническое заболевание вызывает воспаление слизистых оболочек щек, языка, десен и пищевода. Это также может повлиять на гениталии и кожу.У людей с этим заболеванием появляются красные опухшие ткани и белые кружевные пятна на слизистых оболочках. Также могут развиться болезненные, жгучие язвы.

Заболевание может быть аутоиммунным заболеванием и чаще всего встречается у женщин старше 50 лет. Люди с красным плоским лишаем полости рта имеют более высокий риск развития рака полости рта, типа рака головы и шеи. По этой причине важно регулярно получать помощь специалиста по плоскому лихену полости рта. Хотя красный плоский лишай в полости рта неизлечим, правильные методы лечения могут облегчить симптомы и контролировать заболевание.

Красный плоский лишай полости рта — одна из специализаций доктора Фазеля. Она проводит текущие исследования и клинические испытания, чтобы найти новые способы лечения этого расстройства. В зависимости от вашего состояния здоровья вы можете попробовать клиническую пробную терапию или одно из следующих методов лечения:

• Кортикостероиды для местного или перорального применения для уменьшения отека
• Иммунодепрессанты для контроля сверхактивного ответа иммунной системы
• Терапия антителами к внутривенному иммуноглобулину (ВВИГ) для борьбы с инфекциями

Пемфигус и пемфигоид

Эти редкие аутоиммунные заболевания вызывают образование пузырей, заполненных жидкостью, на коже и слизистых оболочках по всему телу.Волдыри могут вызывать болезненный зуд или жжение. Обширное образование пузырей может привести к потере жидкости и инфекциям.

Мы сосредоточены на лечении ваших симптомов и достижении ремиссии болезни. Лечебные процедуры включают:

• Антибиотики для лечения инфекций
• Противовоспалительные препараты для минимизации отеков и воспалений
• В-клеточная терапия (Ритуксан®) для уничтожения аномальных В-клеток
• Кортикостероиды для местного, инъекционного или перорального применения для уменьшения воспаления и отека
• Иммунодепрессанты для управления сверхактивной иммунной системой
• Внутривенное введение иммуноглобулинов (ВВИГ) для выработки антител, которые борются с инфекцией

Рецидивирующий афтозный стоматит

Это состояние вызывает образование болезненных, иногда жгучих волдырей на внутренней поверхности губ или рта.Часто развивается в детстве.

Люди с афтозным стоматитом могут иметь другие заболевания, например:

• Болезнь Бехчета
• Целиакия
• Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ)
• Воспалительное заболевание кишечника

Лечебные процедуры включают:

• Ополаскиватель для полости рта по рецепту для уничтожения бактерий во рту и облегчения боли при язве
• Кортикостероид для местного, перорального или инъекционного применения для уменьшения воспаления
• Иммунодепрессанты для замедления реакции иммунной системы и уменьшения воспаления

Синдром Шегрена

Это аутоиммунное заболевание влияет на выработку слюны и слез, вызывая сухость во рту и глазах.Заболевание чаще всего встречается у женщин старше 40 лет. Оно также может вызывать:

• Проблемы с пищеварением
• Сухая кожа
• Усталость
• Боль в суставах

Люди с синдромом Шегрена часто страдают другими аутоиммунными заболеваниями, такими как ревматоидный артрит или волчанка. Вот почему мы сотрудничаем с экспертами нашей ревмато-дерматологической клиники, чтобы справиться со всеми вашими симптомами. Процедуры могут включать:

• Растворы искусственной слезы для увлажнения и успокоения раздраженных сухих глаз
• Заменители или стимуляторы слюны для увеличения выработки слюны
• Безрецептурные обезболивающие, такие как ибупрофен и ацетаминофен, для облегчения боли
• Противовоспалительные препараты, включая кортикостероиды, для уменьшения отека и воспаления
• Иммунодепрессанты для замедления реакции иммунной системы и уменьшения воспаления
• Антиревматические средства для лечения боли и отека при ревматоидном артрите

Свяжитесь с нами

Чтобы записаться на прием, позвоните по телефону (800) 770-9282 или (916) 734-6111 .

Уремия в сочетании с повреждением слизистой оболочки предрасполагает мышей с заболеванием почек к системной инфекции, вызываемой комменсалом Candida albicans.

Abstract

Инфекции являются второй основной причиной смертности пациентов с заболеванием почек и сопутствующей уремией. И сосудистый доступ, и инфекции, не связанные с доступом, в равной степени способствуют смерти, связанной с инфекциями, у пациентов с заболеванием почек. Диализ является наиболее частой причиной системной инфекции Candida albicans у этих пациентов. С . albicans также находятся в желудочно-кишечном тракте как комменсальный гриб. Однако вклад C . albicans при инфекциях, не связанных с доступом, при заболевании почек неизвестно. Используя мышиную модель заболевания почек, мы демонстрируем, что у уремических животных наблюдалась повышенная проницаемость кишечного барьера, нарушение защиты слизистой оболочки и дисбактериоз. Нарушения гомеостаза кишечника достаточно для перемещения микробиоты и кишечного патогена Citrobacter rodentium во внекишечные участки, но не C . Альбиканс . Интересно, что у большинства уремических животных грибковая транслокация обнаруживалась только тогда, когда нарушалась целостность кишечного барьера. Наши данные демонстрируют, что уремия в сочетании с повреждением слизистой оболочки кишечника может способствовать транслокации C. albicans и вызывать системную инфекцию при заболевании почек. Поскольку большинство людей с заболеванием почек страдают той или иной формой повреждения слизистой оболочки кишечника, эти результаты имеют важное значение для стратификации риска и контроля оппортунистических грибковых инфекций, не связанных с доступом, у этих пациентов.

Введение

Болезнь почек — серьезная проблема общественного здравоохранения в 21 веке (1). Инфекция является второй по значимости причиной смертности (20%) у пациентов с заболеванием почек (2, 3). Хотя инфекции, связанные с сосудистым доступом, являются основной причиной смерти, связанной с инфекциями, при заболевании почек, инфекционные осложнения, не связанные с доступом, хотя и не менее важны, но часто упускаются из виду (4). Исследование показало, что в 77% выявленных случаев госпитализации, связанные с инфекцией, не связаны с сосудистым доступом; скорее, наиболее частой причиной было заражение неизвестного источника (5).Несмотря на то, что достижения в области методов диализа снизили уровень инфекций, связанных с доступом, за последнее десятилетие, профилактика инфекций, не связанных с доступом, по-прежнему остается серьезной проблемой. В большинстве случаев источник инфекций, не связанных с доступом, при заболевании почек, остается неустановленным, что является основным препятствием в борьбе с инфекциями у этих пациентов.

Несколько предрасполагающих факторов делают пациентов с заболеванием почек восприимчивыми к инфекции (6–8). К ним относятся доступ к диализу, наличие сопутствующих заболеваний, гипореактивность вакцины, иммуносупрессивная терапия и уремия.Уремия характеризуется задержкой ~ 900 метаболитов в крови при отсутствии функции почек. Некоторые из них (∼100) оказывают сильное влияние на различные биологические системы и называются уремическими токсинами (9). Уремия участвует в иммунной дисфункции и считается независимым фактором риска инфекций, не зависящим от сосудистого доступа (7, 10). Хотя роль уремии в инфекциях, связанных с доступом, широко изучалась (11, 12), ничего не известно о влиянии уремии на инфекции, не связанные с доступом.

В желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) обитают триллионы микроорганизмов, называемых кишечной микробиотой, которые играют важную роль в пищеварении и метаболизме хозяина (13). Микробиота также участвует в развитии метаболических, воспалительных и инфекционных заболеваний, если гомеостаз кишечника нарушен (14, 15). Эпителиальные клетки кишечника поддерживают симбиотические отношения между микробиотой и хозяином, разделяя их. Барьерная функция слизистой оболочки регулируется постоянным взаимодействием между микробиотой и иммунными клетками хозяина.Такие взаимодействия также важны для поддержания баланса между симбионтами и патобионтами и предотвращения дисбактериоза. Следовательно, измененный гомеостаз кишечника способствует проникновению микроорганизмов в кровоток, что приводит к системным инфекциям и воспалительным заболеваниям.

Накапливающиеся данные указывают на то, что перекрестный разговор между хозяином и микробиотой имеет патофизиологическое значение при заболевании почек. Уремия влияет как на состав, так и на метаболизм микробиоты кишечника (16). Кроме того, у 80% всех пациентов с уремией наблюдаются проявления со стороны желудочно-кишечного тракта, при которых повреждена эпителиальная выстилка кишечника (17, 18).Напротив, многие уремические токсины, происходящие из микробного метаболизма, вызывают повреждение почечных и сосудистых клеток (16, 19). В последнее десятилетие были предприняты значительные усилия для понимания роли кишечных уремических токсинов в заболеваниях почек и сосудов. Однако не уделялось большого внимания исследованию того, могут ли кишечные микроорганизмы вызывать не связанные с доступом оппортунистические инфекции при уремии.

Candida albicans вызывает тяжелую внутрибольничную системную инфекцию, известную как диссеминированный кандидоз (20). С . a lbicans составляет 79% всех системных грибковых инфекций у пациентов с заболеванием почек (21). Инвазивные медицинские процедуры являются основными источниками диссеминированного кандидоза у этих пациентов (21). C. albicans также является грибком-комменсалом в желудочно-кишечном тракте человека (22). В моделях на мышах гриб обычно находится в желудочно-кишечном тракте и не перемещается, если у животных не проявляется нейтропения и нарушение целостности кишечного барьера (23-25). Однако неясно, является ли комменсал C . albicans может вызывать системную инфекцию при уремии.

В этом отчете, используя хорошо подтвержденную модель заболевания почек и ассоциированной уремии у мышей, мы демонстрируем, что нарушение слизистой оболочки кишечника при уремии может способствовать перемещению C . albicans и вызывают системную инфекцию. В совокупности эти результаты подчеркивают роль комменсала C . albicans вызывает оппортунистическую инфекцию, связанную с несосудистым доступом, у подгруппы пациентов с заболеванием почек, у которых уремия сочетается с повреждением слизистой оболочки кишечника.

Материалы и методы

Мыши

Самцов мышей C57BL / 6NTac (дикого типа [WT]) были приобретены у Taconic Biosciences (Germantown, NY). Всех мышей содержали в определенных условиях, свободных от патогенов, под наблюдением Отдела ресурсов лабораторных животных. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами Национального института здравоохранения в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Питтсбургского университета (протокол № 20087922).

Нефропатия, связанная с аристолоховой кислотой I

Чтобы вызвать дисфункцию почек, мышам вводили внутрибрюшинную инъекцию. с 10 мг / кг аристолоховой кислоты I (AAI) (Sigma). Мышам в группе химического контроля вводили внутрибрюшинно. с 10 мг / кг аристолоховой кислоты II (AAII) (Sigma), а контрольные животные получали i.p. инъекция равного объема PBS. Для исследования фармакологического ингибирования мышей лечили следующим образом: 1) однократным внутрибрюшинным введением. инъекция AAI в дозе 10 мг / кг; 2) мыши из группы пробенецид + AAI были i.п. инъецировали пробенецид в дозе 150 мг / кг массы тела за 30 мин до введения AAI, и 3) мышам группы, получавшей только пробенецид, вводили i.p. вводят пробенецид в дозе 150 мг / кг.

Опосредованное декстрансульфатом натрия повреждение эпителия кишечника

Мыши получали 2,5% декстрансульфат натрия (DSS) (36 000–50 000 масс.) (MP Biomedicals) с питьевой водой в течение 5 дней. Контрольные животные в течение всего периода получали воду в автоклаве. Ежедневно наблюдали за массой тела мышей.

Мышам вводили через желудочный зонд 2 × 10 ⁸ КОЕ C. albicans (штамм SC5314). Для установления кишечной колонизации C. albicans мышам добавляли ампициллин (1 мг / мл) в питьевой воде за 2 дня до перорального введения через желудочный зонд C. albicans . После этого на протяжении всего эксперимента мышей содержали на питьевой воде с добавлением ампициллина. C. albicans Колонизацию в желудочно-кишечном тракте подсчитывали путем культивирования фекального содержимого на агаре с дрожжевым экстрактом пептон-декстрозой (YPD) с добавлением 0.010 мг / мл ванкомицина и 0,100 мг / мл гентамицина. Ткани печени и селезенки гомогенизировали и высевали на агар YPD для определения системного распространения C. albicans .

Мышей инфицировали через желудочный зонд 2 × 10 ⁹ КОЕ C. rodentium (штамм DBS100). Мышей ежедневно взвешивали и наблюдали за признаками болезни или дистресса. Подсчет бактерий определяли в свежесобранных фекальных гранулах или в печени и селезенках, собранных в асептических условиях, путем гомогенизации в PBS с последующим посевом серийных разведений гомогената на чашки с агаром MacConkey.

Односторонняя обструкция мочеточника

Модель заболевания почек с односторонней обструкцией мочеточника (UUO) была индуцирована у самцов мышей WT в возрасте 8 недель путем перевязки левого мочеточника.

Измерение уровней азота мочевины и креатинина в сыворотке крови

Азот мочевины в сыворотке крови (BUN) измеряли с помощью набора BUN Enzymatic Kit (Bioo Scientific), а уровни креатинина измеряли с помощью набора QuantiChrom Creatinine Assay Kit (BioAssay Systems).

Анализ кишечной проницаемости FITC – декстраном

Пища была прекращена у мышей в течение 4 часов до введения FITC – декстрана через зонд.FITC-декстран (4 кДа; Sigma) ресуспендировали в PBS в концентрации 100 мг / мл и вводили перорально каждой мыши через зонд в дозе 40 мг / 100 г массы тела. Через четыре часа мышей умерщвляли и немедленно собирали кровь путем ретроорбитального кровотечения в пробирки, содержащие антикоагулянт. Плазму выделяли из образцов крови. Сто микролитров плазмы добавляли в черный 96-луночный микропланшет в двух экземплярах. Концентрацию FITC в плазме определяли с помощью спектрофотометрической флуорометрии при возбуждении 485 нм (ширина полосы 20 нм) и длине волны излучения 528 нм (ширина полосы 20 нм) с использованием стандартного серийно разбавленного FITC – декстрана.Плазму мышей, которым вводили PBS, использовали для определения фона.

Анализ бактериальной транслокации или

Мышей умерщвляли, а образцы печени и селезенки, собранные в асептических условиях, гомогенизировали в PBS. Гомогенаты тканей высевали на агар для инфузии мозга и сердца и чашки с агаром YPD для анализа бактериальной и грибковой транслокации соответственно.

Приготовление суспензий тканевых клеток и проточно-цитометрический анализ

Селезенку и брыжеечные лимфатические узлы (MLN) собирали у мышей и подвергали механической диссоциации для приготовления суспензий единичных клеток с последующим лизисом эритроцитов аммоний-хлоридно-калиевым лизирующим буфером (Thermo Fisher Scientific).Были выделены лейкоциты собственной пластинки тонкой кишки (SILP). Вкратце, пятна Пейера были аккуратно вырезаны из 10-сантиметрового куска терминальной части тонкой кишки (SI). Ткани кишечника вскрывали в продольном направлении и промывали HBSS для удаления содержимого просвета. Ткани инкубировали с 20 мл HBSS, содержащего 5 мМ EDTA, в течение 20 минут при 37 ° C в инкубаторе с встряхиванием для удаления эпителиальных клеток. Ткани разрезали на мелкие кусочки и инкубировали в 10 мл RPMI 1640, содержащего 0,3 мг / мл коллагеназы D и 0.1 мг / мл ДНКазы I в течение 20 мин при 37 ° C на встряхиваемой водяной бане. Затем добавляли 10% FBS, чтобы остановить активность переваривающих ферментов, и тканевую суспензию пропускали через клеточный фильтр с размером ячеек 70 микрон. Суспензию клеток дважды промывали RPMI 1640, содержащим 10% FBS, и пропускали через клеточный фильтр 40 мкм для удаления остатков ткани.

и ПЦР в реальном времени.

экстрагировали из тканей кишечника с использованием наборов RNeasy (QIAGEN, Valencia, CA). кДНК была синтезирована с помощью SuperScript III First Strand Kits (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA).Количественную ПЦР в реальном времени проводили с помощью PerfeCTa SYBR Green FastMix (Quanta BioSciences, Беверли, Массачусетс) и анализировали на приборе реального времени ABI 7300. Праймеры были получены из анализа праймеров QuantiTect (QIAGEN). Экспрессия каждого гена была нормализована к экспрессии GAPDH.

Секвенирование и анализ кишечного микробиома

Фекальная ДНК была выделена с использованием набора для экстракции ДНК стула QIAamp. В анализе микробного сообщества использовалась ПЦР-амплификация рРНК 16S с последующим секвенированием на Illumina MiSeq.Последовательности из Illumina MiSeq были деконволюционированы, а затем обработаны с помощью центра медицины и внутреннего конвейера контроля качества микробиома, который включает фильтрацию пыли низкой сложности, обрезку значений качества, обрезку праймеров, используемых для амплификации гена 16S рРНК, и минимальное считывание фильтрация по длине. Прямые и обратные чтения были объединены в контиги, а затем обработаны с помощью Центра медицины и конвейера кластеризации 16S и аннотации последовательностей Microbiome, основанного на Mothur.Таксономические классификации последовательностей были выполнены с помощью проекта Ribosomal Database Project и наивного байесовского классификатора со справочной базой данных Silva. Профили микробиоты были статистически количественно оценены и проанализированы с использованием трех различных методов на таксономическом уровне рода: методы, основанные на расстоянии (межвыборочная разница), использовали метрику расстояния Манхэттена, методы, основанные на распределении (например, разнообразие), использовали статистику хвоста и индекс Шеннона, а также численность -основанные методы использовали преобразование аддитивно-логарифмического отношения.Временные точки выборки (исходный уровень и 10 дней после инъекции AAI) от одного и того же субъекта были объединены в пары, и линейные модели были сопоставлены с парными различиями в качестве ответа (парный анализ).

Гистология

Ткани терминальной части подвздошной кишки и толстой кишки фиксировали 10% забуференным формальдегидом и заливали парафином. Были сделаны срезы толщиной 4 мкм, окрашены H&E и затем исследованы патологом, не осведомленным о дизайне исследования, с помощью световой микроскопии.

Иммунофлуоресцентное окрашивание

Срезы замороженного SI и толстой кишки фиксировали в 4% параформальдегиде и окрашивали первичным Ab ZO-1 (Invitrogen).В качестве вторичного антитела использовали козий антикроличий Cy3. Затем срезы окрашивали ядерным красителем DAPI. Изображения были получены с помощью микроскопа EVOS FL Auto (Life Technologies).

Статистический анализ

Все данные выражены как среднее ± стандартное отклонение. Статистический анализ проводился с использованием ANOVA, Манна-Уитни или непарного теста Student t с помощью программы GraphPad Prism 7: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, и **** п <0.0001. Все эксперименты проводились как минимум дважды в независимо выполненных повторностях.

Результаты

Уремические мыши демонстрируют повышенную проницаемость кишечника

Используя мышиную модель AAI-нефропатии (AAN) (26), мы проверили, влияет ли уремия на гомеостаз кишечника и вызывает ли диссеминированный кандидоз. В этом исследовании у мышей, которым вводили AAI, наблюдались дисфункция почек и уремия (рис. 1A). Контрольные животные получали PBS. AAII использовали в качестве нефротоксичного контроля. Сначала мы измерили влияние уремии на барьерную функцию кишечника у мышей с AAN.Уремические мыши показали 10-кратное увеличение проницаемости кишечного барьера по сравнению с контрольной группой (рис. 1В). Увеличение проницаемости барьера было максимальным примерно через 6-10 дней после инъекции AAI, момент времени, когда уровень BUN достиг пика в уремической группе, как показано ранее (26) (рис. 1C, 1D). Следовательно, уремические животные показали сниженную экспрессию белка плотных контактов ZO-1 в эпителиальной выстилке SI и толстой кишки (рис. 1E). Произошло увеличение экспрессии нескольких генов белков плотных контактов (ZO1, окклюдин и клаудин 4), что свидетельствует о начале репарационных реакций в дисфункциональном эпителии кишечника, как описано ранее (27) (рис.1F). Утрата барьерной функции при уремии не была связана с повреждением слизистой оболочки SI и толстой кишки (рис. 1G).

Повышенная проницаемость кишечного барьера у мышей, которым вводили AAI. Мышам

C57BL / 6 (WT) ( n = 6–8) вводили либо AAI, PBS (контроль), либо AAII. ( A ) Уровни мочевины и креатинина в сыворотке ( n = 5) измеряли на 10-й день после инъекции AAI. На ( B ) день 10 ( n, = 6-8) и ( C ), указанные временные точки после инъекции AAI ( n = 3-6), мышам вводили через зонд FITC-декстран и оценивали на Концентрация FITC – декстрана в плазме.( D ) Корреляция между проницаемостью кишечного барьера и уровнем АМК ( n = 8). ( E ) Срезы SI и толстой кишки окрашивали на экспрессию ZO-1. ( F ) Транскриптную экспрессию генов белков плотных контактов оценивали с помощью количественной ПЦР в реальном времени ( n = 6-7). ( G ) Окрашивание H&E SI и толстой кишки уремических и контрольных мышей. Изображения от одной из трех мышей / группы для (E и G). Оригинальное увеличение × 200. Данные объединены по крайней мере из двух независимых экспериментов для (A – D и F) и выражены как среднее ± стандартное отклонение (A, B, C и F).Статистический анализ с помощью корреляции Пирсона (D) и однофакторного дисперсионного анализа (A – C и F). ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001.

Затем мы определили, является ли повреждение почек ответственным за изменение проницаемости кишечного барьера независимо от уремии. Чтобы проверить эту проблему, мы адаптировали модель фиброза почек UUO, в которой один из мочеточников лигирован ниже почки, тогда как контралатеральный мочеточник остается нетронутым, что позволяет нормально функционировать нелигированной почке (28).Следовательно, UUO вызывает одностороннее поражение почек, но не уремию (рис. 2A – C). Мыши с UUO не показали изменений проницаемости кишечного барьера по сравнению с контролем без UUO (фиг. 2D), что указывает на то, что увеличение проницаемости кишечника связано с уремией, а не с повреждением почек как таковым. Более того, чтобы определить, является ли повышенная проницаемость следствием прямого воздействия AAI на эпителиальные клетки кишечника, мышей, которым вводили AAI, вводили пробенецид, ингибитор переносчика органических анионов, который предотвращает дисфункцию почек и уремию без нейтрализации AAI (29) (рис.2E – G). Уремические мыши, получавшие пробенецид, показали снижение содержания FITC-декстрана в плазме, что указывает на то, что AAI не оказывает никакого прямого влияния на проницаемость барьера (рис. 2H). Эти данные предполагают, что уремия увеличивает проницаемость барьера у мышей с заболеванием почек (12).

Уремия способствует увеличению проницаемости кишечника.

( A ) Принципиальная схема экспериментального проекта. Мышей WT ( n = 5–6) подвергали UUO. На 7-й день после операции контрольным мышам UUO и не-UUO вводили через зонд FITC-декстран и оценивали проницаемость барьера.( B ) Гистопатологию почек после окрашивания трихома по Массону, ( C ) сывороточный уровень BUN и ( D ) плазменную концентрацию FITC – декстрана измеряли на 7 день после операции. ( E ) Принципиальная схема экспериментального дизайна. Группы мышей с уремией ( n = 6-7) либо получали пробенецид (AAI + PRB), либо оставались без лечения (AAI). Контрольные мыши получали только пробенецид (только PRB). Мышей оценивали на ( F ) фиброз почек, ( G ) уровень мочевины в сыворотке и ( H ) проницаемость кишечного барьера.Изображения одной из трех мышей / группы для (B и F). Оригинальное увеличение × 200. Данные объединены по крайней мере из двух независимых экспериментов для (C, D, G и H) и выражены как среднее ± стандартное отклонение (C, D, G и H). Статистический анализ с помощью теста Стьюдента t (C и D) и однофакторного дисперсионного анализа (G и H). нс, статистически не значимо. **** п <0,0001.

Уремия вызывает изменения в защите слизистой оболочки и составе микробиоты кишечника

Клетки врожденного и адаптивного иммунитета играют особую, но дополняющую роль в поддержании гомеостаза кишечника и иммунной защиты слизистой оболочки (30).В SILP процентное содержание субпопуляций макрофагов и дендритных клеток было сопоставимым между уремическими и контрольными мышами (фиг. 3A, 3B). Поразительно, но мы наблюдали снижение процента нейтрофилов в SILP уремических мышей, а не в контроле (рис. 3C). Уремические мыши также продемонстрировали снижение процента клеток Th27, но не клеток Th2 (рис. 3D). Заметно, что процент плазмобластов IgA ⁺ CD11b ⁺ в SILP уремических мышей был снижен по сравнению с процентом у контрольных животных (рис.3E). Наблюдалась тенденция к уменьшению плазмобластов IgA ⁺ CD11b ^— при уремии, хотя различия между группами не достигли статистической значимости. Однако частота регуляторных T (Treg) -клеток была одинаковой между группами (рис. 3F). Мы не наблюдали разницы в частотах клеток Th27, Th2 и Treg в MLN между уремическими и неуремическими группами (рис. 3G, 3H). Эти результаты показывают, что уремия отрицательно влияет на количество нейтрофилов, Th27 и IgA-продуцирующих плазмобластов в SILP.

Нарушение иммунитета слизистой оболочки кишечника и дисбактериоз при уремии.

На 10 день после инъекции AAI SILP ( n = 5-19) оценивали на частоту ( A ) макрофагов (liveCD45 ⁺ CD11b ⁺ F4 / 80 ⁺ CX3CR1 ⁺ CD11c ⁺ ; liveCD45 ⁺ CD11b ⁺ F4 / 80 ⁺ CX3CR1 ⁺ CD11c ^— ), ( B ) дендритные клетки (liveCD45 ^{+ CD45 CD11c + , liveCD45 + CD11b — CD103 + CD11c + ; liveCD45 + CD11b + CD103 — CD11c + 9013roph CD11b + Ly6G + ), ( D ) Th27 (liveCD45 + CD4 + IL-17 + ) и Th2 (liveCD45 + CD4 + IFN +} ), ( E ) IgA-продуцирующие плазмобласты (liveCD45 ⁺ CD11b ⁺ IgA ⁺ ; liveCD45 ⁺ CD11b ^— IgA ⁺ ) и ( F ) Treg-клетки (liveCD4 ⁺ Foxp3 ⁺ ) с помощью FACS на 10 день после инъекции AAI.( G ) Процент клеток Th27 и Th2 в MLN ( n = 8–12) определяли путем окрашивания внутриклеточных цитокинов после стимуляции in vitro PMA / иономицином. ( H ) Частоту Treg-клеток определяли в MLN с помощью FACS. ( I ) На 10 день после инъекции AAI фекальные гранулы уремических и контрольных ( n = 5) мышей подвергали целевому секвенированию 16S рРНК. Данные объединены по крайней мере из двух независимых экспериментов для (A – H) и выражены как среднее ± стандартное отклонение (A – H).Статистический анализ методом однофакторного дисперсионного анализа (A – H) и попарно с использованием критерия суммы рангов Вилкоксона (I). * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.

Затем мы оценили относительное изменение разнообразия и состава кишечной микробиоты уремических и контрольных животных между 0 (исходный) и 10-м днями после инъекции AAI. Не было значительных различий в разнообразии микробиоты между уремической и контрольной группами на 10-й день после инъекции AAI (рис.3I). Как контрольные животные, так и животные, которым вводили AAII, продемонстрировали измененный состав микробиоты между 0 и 10 днями. Интересно, что уремические мыши показали значительно большее изменение ( p = 0,0094) в общем составе микробиоты, чем контрольные животные на 10 день после инъекции. В то время как в контрольной группе наблюдалось снижение численности Tannerellaceae и Lactobacillus , у уремических животных наблюдалось увеличение численности Tannerellaceae . В совокупности эти результаты показывают умеренное влияние уремии на состав кишечной микробиоты уремических мышей.

Уремические мыши демонстрируют транслокацию кишечной микробиоты и

Мы оценили, может ли вызванное уремией нарушение гемостаза кишечника управлять транслокацией кишечной микробиоты. Хотя нам не удалось обнаружить какие-либо бактериальные колонии у контрольных мышей или мышей AAII, 30-50% уремических животных показали транслокацию микробиоты в печени и селезенке на 10-й день после инъекции AAI (рис. 4A). Более того, у мышей с уремией, получавших пробенецид, не было обнаружено бактериальных колоний в печени и селезенке (рис.4Б). Транслокация микробиоты вызвала активацию Т-клеток в MLN и селезенке уремических мышей, как показано ранее (рис. 4C, 4D) (12).

Уремические мыши демонстрируют транслокацию кишечной микробиоты.

( A ) Мышей ( n = 6) подвергали AAN и оценивали на транслокацию кишечной микробиоты в печень и селезенку на 10 день после инъекции AAI. Изображения от одной из шести мышей / группы. ( B ) Уремических мышей ( n = 6) либо лечили пробенецидом (AAI + PRB), либо оставляли без лечения (AAI) и оценивали на транслокацию микробиоты в печени и селезенке.Уремическую и контрольную группы ( n = 6–9) оценивали на активацию Т-клеток в ( C ) MLN (liveCD4 ⁺ CD44 ^hi ) и ( D ) селезенке (liveCD4 ⁺ CD62L ^lo CD44 ^hi и liveCD8 ⁺ CD62L ^lo CD44 ^hi ) по FACS. Объединенные данные по крайней мере двух экспериментов для (A – D) и выраженные как среднее ± стандартное отклонение (C и D). Статистический анализ с помощью однофакторного дисперсионного анализа (C и D). * p <0.05, ** p <0,01, **** p <0,0001.

Затем мы оценили способность вредоносных бактерий C. rodentium вызывать системную инфекцию у уремических животных (рис. 5А). С . rodentium является кишечным патогеном мышей, который тесно связан с патогенами человека, включая энтеропатогенные Escherichia coli и энтерогеморрагические E . coli (31). После орального заражения мы наблюдали еще C . rodentium в фекальном осадке и содержимом слепой кишки уремических мышей (рис. 5В). Несколько контрольных мышей показали очень низкое количество колоний C . rodentium в печени и селезенке, как показано ранее (32) (рис. 5C). Напротив, 60–70% уремических животных показали более высокий C . rodentium нагрузка на печень и селезенку. Наши данные позволяют предположить, что микробиота кишечника и . rodentium может перемещаться из кишечника и вызывать системную инфекцию при уремии.

Уремические мыши обнаруживают транслокацию C. rodentium .

( A ) Принципиальная схема экспериментального проекта. AAI, контрольным мышам и мышам, которым инъецировали AAII ( n = 12) вводили через зонд C . rodentium на 3-й день после инъекции AAI. На 7 день измеряли содержание C. rodentium в фекальном осадке ( B ) и содержимое слепой кишки и ( C ) печень и селезенку. Объединенные данные по крайней мере из двух экспериментов для (B и C) и выраженные как среднее ± стандартное отклонение (B и C).Статистический анализ с помощью однофакторного дисперсионного анализа (B и C). * p <0,05.

Уремия и повреждение слизистой оболочки необходимы для транслокации

Роль C , происходящего из кишечника. albicans при инфекциях, не связанных с доступом, при заболевании почек неизвестно. На основании наших данных (рис. 4, 5) мы предполагаем, что C . albicans может перемещаться и вызывать диссеминированный кандидоз при уремии. С . albicans не является грибком-комменсалом у мышей.Следовательно, колонизация гриба требует изменения гомеостаза кишечника (33). После перорального желудочного зондирования уремические мыши показали умеренное увеличение грибковой колонизации в кишечнике на 7 день после инъекции (фиг. 6A, 6B). Мы не смогли обнаружить какие-либо грибковые колонии в печени и селезенке уремических животных в этот момент времени (рис. 6С). Мы также лечили уремических и контрольных мышей пероральным антибиотиком, чтобы способствовать устойчивой колонизации (34) (рис. 6D, 6E). Однако у уремических животных не было обнаружено распространения грибка в органах (рис.6F). Таким образом, в отличие от C . родентиум , С . albicans не может перемещаться из кишечника при уремии.

Уремические мыши демонстрируют грибковую транслокацию после обработки DSS.

( A ) Схематическое изображение экспериментального плана. Мышам ( n = 10–15) вводили через желудочный зонд C . albicans на 2 день после инъекции AAI. На 8 день C . Были оценены albicans и нагрузка микробиоты в фекальном осадке ( B ) и ( C ) в печени и селезенке.( D ) Принципиальная схема экспериментального плана. Мышей ( n = 6–13) кормили ампициллином с питьевой водой на протяжении всего эксперимента. На 10 день после перенесенной грибковой инфекции мышам вводили либо AAI, либо PBS. Определяли КОЕ грибков и бактерий в фекальном осадке ( E ) и в печени и селезенке ( F ). ( G ) Схематическое изображение плана эксперимента. Животных, которым перорально вводили антибиотики, давали 2,5% DSS в воде через 3 дня после инъекции AAI.( H ) Выживаемость ( n = 4–8) оценивалась через 9 дней после инъекции AAI. ( I ) Мышей оценивали на предмет транслокации C. albicans в печень. Объединенные данные по крайней мере двух экспериментов для (B, C, E, F, H и I) и выраженные как среднее ± стандартное отклонение (B и E). Статистический анализ с помощью однофакторного дисперсионного анализа (B), критерия Манна – Уитни t (E) и критерия логарифмического ранга (H). * p <0,05, ** p <0,01.

Большинство пациентов с заболеваниями почек страдают от тех или иных проявлений желудочно-кишечного тракта, при которых поражается слизистая оболочка кишечника (17).К ним относятся перфорация кишечника, язва кишечника, уремический колит, ишемический колит, дивертикулярная болезнь и кишечное кровотечение. Следовательно, мы проверили, соответствует ли C . albicans может вызвать системную инфекцию, когда слизистая оболочка кишечника повреждена уремией. Соответственно, уремических и контрольных мышей кормили антибиотиком для содействия колонизации с последующим пероральным зондом с 2,5% DSS для повреждения эпителиальной выстилки (23) (фиг. 6G). Мыши с инъекцией AAI, получавшие DSS, показали снижение выживаемости (30%) по сравнению с только AAI, только контролем и контрольными животными + DSS (100%) (рис.6H). Контрольные животные с DSS не показали распространения грибков в печени, как показано ранее (23) (рис. 6I). Не было грибковой транслокации у уремических мышей, не получавших DSS. Интересно, что 65% уремических животных, получавших DSS, показали транслокацию грибков в печени. Эти данные указывают на то, что C . albicans может перемещаться и вызывать системную инфекцию только тогда, когда у большинства уремических животных поврежден барьер слизистой оболочки. Таким образом, разумно предположить, что у уремических людей с проявлениями желудочно-кишечного тракта может быть более высокий риск системной инфекции кишечного происхождения C . Альбиканс .

Обсуждение

Профилактика инфекций — один из немногих способов сокращения госпитализаций, контроля затрат и улучшения качества жизни пациентов с заболеванием почек. За последнее десятилетие технический прогресс в процедуре диализа снизил частоту инфекций, связанных с доступом. Однако не удалось предотвратить госпитализацию у этих пациентов, связанную с инфекцией (2, 3). Отчасти это связано с тревожным ростом распространенности ранее недооцененных инфекций, не связанных с доступом.В настоящее время наши знания о риске и источниках инфекций, не связанных с доступом, у пациентов с заболеванием почек на удивление рудиментарны. Используя клинически значимую модель заболевания почек и ассоциированной уремии у мышей, мы показываем, что кишечник комменсал C . albicans вызывает системную инфекцию, когда уремия сочетается с повреждением слизистой оболочки. Эти результаты идентифицируют комменсал C кишечного происхождения. albicans как источник системной инфекции, не связанной с доступом, у пациентов с заболеванием почек и с поражением желудочно-кишечного тракта.

Наши данные показывают, что потеря барьерной функции у уремических мышей происходит из-за увеличения проницаемости кишечного барьера и повреждения слизистой оболочки. Уровень уремии коррелирует с потерей барьерной функции, указывая на то, что уремия напрямую связана с повышенной проницаемостью кишечника. Хотя наше исследование предоставило доказательства повышенной проницаемости кишечника у 100% мышей с уремией, только 30–50% животных постоянно демонстрировали транслокацию микробиоты. Эти данные предполагают, что другие факторы, помимо увеличения проницаемости кишечника, играют важную роль в бактериальной транслокации при уремии.Причем при микробиоте и C . rodentium обнаружил транслокацию, C . albicans не смогли этого сделать. Грибковые дрожжи (2–10 мкм) и гифы (> 10 мкм) больше по размеру, чем бактерии (0,5–5 мкм), что может препятствовать прохождению грибковых дрожжей и гифы через плотные соединения желудочно-кишечного тракта. эпителиальные клетки. Кроме того, у контрольных или уремических мышей не наблюдается грибковой транслокации без повреждения слизистой оболочки. Эти данные свидетельствуют против того, что C . albicans может перемещаться, вызывая повреждение эпителиальных клеток желудочно-кишечного тракта, как предполагают другие (35).

Дисбиоз, наблюдаемый в этом исследовании, может быть вызван ятрогенными причинами или уремией как таковой. Нарушение функции почек приводит к диффузии мочевины в желудочно-кишечном тракте. Последующий гидролиз мочевины уреазой, экспрессируемой некоторыми кишечными микробами, приводит к образованию большого количества аммиака, который может повлиять на рост комменсальных бактерий (16, 19). Мы наблюдали умеренное изменение микробиоты кишечника в нашей мышиной модели AAN.Это контрастирует с пациентами с хроническим заболеванием почек, у которых очевидно изменение количества и качества микробиоты (16, 19). Причин такого расхождения может быть несколько. Во-первых, AAN представляет собой модель острого повреждения почек, в которой кишечные бактерии подвергаются воздействию уремических токсинов в течение относительно короткого периода времени (например, 7-10 дней). Во-вторых, микробиота мышей и человека значительно различается, и их восприимчивость к уремии может отражать разницу в изменениях бактериального состава кишечника (36).Наконец, уремические токсины различаются между мышами и людьми, что затрудняет сравнение их воздействия на микробиоту кишечника (37).

Мы наблюдали снижение процентного содержания клеток врожденного и адаптивного иммунитета в SILP уремических мышей. Апоптоз нейтрофилов, вызванный уремией, может быть причиной снижения количества нейтрофилов в уремической кишке (38). Это наблюдение согласуется с предыдущим сообщением, показывающим, что нейтропения, индуцированная иммуносупрессивным лечением, необходима для того, чтобы гриб мог перемещаться и вызывать системную инфекцию у неуремных животных (23).Кроме того, дефицит IgA-продуцирующих плазмобластов у уремических мышей может быть одновременно опосредован усилением апоптоза В-клеток и снижением экспрессии BAFF-R, как было продемонстрировано ранее (39). Роль IgA в C . albicans колонизация и транслокация плохо изучены. Интересно, что мы не наблюдали никаких изменений в Treg-клетках в кишечнике, что является отличительной чертой пациентов с хроническим заболеванием почек (40).

Симптомы со стороны желудочно-кишечного тракта обнаруживаются почти у 80% пациентов с заболеванием почек (17).Некоторые из этих симптомов, в том числе некроз кишечника, спонтанная перфорация толстой кишки, уремический колит, язва желудка, желудочно-кишечное кровотечение и острый дивертикулит, приводят к повреждению слизистой оболочки и развитию сепсиса. Таким образом, разумно предположить, что уремические люди с проявлениями желудочно-кишечного тракта могут иметь более высокий риск системной инфекции комменсалом C . Альбиканс . На сегодняшний день нет исследований, посвященных распространенности диссеминированного кандидоза у уремических пациентов с проявлениями желудочно-кишечного тракта.Кроме того, эти результаты имеют убедительное значение для стратификации риска и клинического управления инфекционным контролем и профилактикой у пациентов с заболеванием почек.

Раскрытие информации

У авторов нет финансового конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарим докторов наук. Саре Гаффен, Тиму Хэнду и Мэнди МакГичи за предложения.

Сноски

• Эта работа была поддержана грантами Национального института здравоохранения AI142354, DK104680 и R21AI45242 на имя P.С.

• Сокращения, использованные в этой статье:

  AAI

  аристолоховая кислота I

  AAII

  аристолоховая кислота II

  AAN

  AAI нефропатия 918 918 918 918 2 918 918 918 918 918 918 918 918 21 азот в крови сульфат натрия

  GI

  желудочно-кишечный

  MLN

  мезентериальный лимфатический узел

  SI

  тонкий кишечник

  SILP

  тонкая кишка lamina propria

  918 918 918 918 918 918 918 регулятивная непроходимость Treg

  918U

  дикого типа

  YPD

  дрожжевой экстракт пептон-декстроза.

• Получено 30 декабря 2020 г.
• Принято 30 декабря 2020 г.

• Авторские права © 2021 Авторы

Заживление слизистой оболочки при воспалительном заболевании кишечника

17 ноября 2017 г.

Воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) — хроническое воспалительное заболевание, которое может вызывать прогрессирующие функциональные и структурные повреждения желудочно-кишечного тракта. Лечебные методы лечения ВЗК традиционно сосредоточены на контроле симптомов.Хотя использование пероральных аминосалицилатов и кортикостероидов может быть эффективным для подавления воспалительного процесса и индукции симптоматической ремиссии, не было показано, что этот подход изменяет естественную историю ВЗК, снижает частоту долгосрочных осложнений или улучшает долгосрочные исходы для пациентов. Этот факт в сочетании с доступностью других терапевтических подходов, которые могут вызвать заживление слизистой оболочки, заставил врачей и исследователей усомниться в том, является ли контроль симптомов наиболее подходящей терапевтической целью при лечении ВЗК.

Смена парадигмы

По словам Эдварда В. Лофтуса-младшего, доктора медицины, гастроэнтеролога, специализирующегося на ВЗК в кампусе клиники Мэйо в Рочестере, штат Миннесота, многие эксперты теперь выступают за смену парадигмы, которая делает упор на заживление слизистой оболочки, а не на клиническую ремиссию. в качестве основной цели лечения. «Лечение, направленное на заживление слизистых оболочек, которое может благоприятно изменить естественное течение ВЗК при использовании в подходе« лечение к цели », получает признание», — говорит д-р.Лофтус.

Инструменты для оценки серьезности заболевания

Доктор Лофтус отмечает, что важно понимать, что точная оценка активности и тяжести заболевания при ВЗК по-прежнему является сложной задачей. Два широко используемых инструмента, основанный на симптомах индекс активности болезни Крона (CDAI) и эндоскопический индекс тяжести болезни Крона (CDEIS), часто рисуют очень разные картины активности болезни.

«У пациентов с болезнью Крона, получающих лечение преднизолоном, данные исследований показывают полное отсутствие корреляции между CDAI и CDEIS», — объясняет д-р.Лофтус. «Это говорит о том, что сосредоточение внимания только на тяжести симптомов может быть неподходящим показателем терапевтической эффективности, потому что симптомы болезни Крона нечувствительны и неспецифичны для воспаления кишечника».

Наличие как воспаления, так и структурного повреждения кишечника у бессимптомных пациентов также подчеркивает полезность получения эндоскопических доказательств заживления слизистой оболочки или других объективных маркеров воспаления для принятия терапевтических решений и оценки их эффективности в исследованиях лечения ВЗК.

«Сосредоточение внимания на заживлении слизистой оболочки снижает потребность в стероидах, риск госпитализации и хирургического вмешательства, — говорит доктор Лофтус, — поэтому алгоритмы лечения, учитывающие результаты эндоскопии при принятии решений, могут лучше справиться с достижением долгосрочной ремиссии и сокращением осложнения «.

Первоначальные результаты исследования

Идея использования заживления слизистой оболочки в качестве конечной точки для оценки активности заболевания и ремиссии у пациентов с ВЗК впервые привлекла внимание, когда исследователи показали, что лечение азатиоприном и инфликсимабом вызывает как симптоматическое улучшение, так и эндоскопическую ремиссию у пациентов с болезнью Крона ( CD).С тех пор многочисленные исследования показали, что признаки заживления слизистой оболочки после начального лечения связаны со снижением риска колэктомии и риска колоректального рака у пациентов с язвенным колитом (ЯК), а также с уменьшением потребности в стероидах и хирургическом вмешательстве у пациентов с CD.

Исследователи, изучающие различные схемы лечения до достижения цели, показали, что скорость заживления слизистых оболочек достигает 70-80 процентов у пациентов с БК и 80-90 процентов у пациентов с ЯК. Испытание REACT представляло собой кластерное рандомизированное испытание, в котором методы рандомизировались либо на алгоритмический подход к БК, при котором лечение увеличивалось каждые четыре недели в зависимости от симптомов, либо на традиционный подход.Результаты, опубликованные в The Lancet в 2015 году, REACT показали, что алгоритмический подход со временем снижает количество осложнений по сравнению с традиционным лечением.

Исследование CALM, представленное в аннотации на Неделе пищеварительных заболеваний 2017, показало, что алгоритмический подход, основанный на снижении уровня С-реактивного белка в сыворотке и кальпротектина в фекалиях, привел к гораздо более высокому уровню заживления слизистой оболочки, чем традиционный подход. «Мы увидим больше данных последующего наблюдения за этими пациентами в будущем с точки зрения госпитализаций, потребности в хирургических операциях и хирургических осложнений», — отмечает д-р.Лофтус.

Ключевые элементы программы «лечение до цели»

• Отсутствие изъязвлений слизистой оболочки является основной терапевтической целью.
• Требуемый целевой уровень должен быть установлен после базовой оценки активности заболевания и поддерживаться неопределенно долго, и он может корректироваться по мере необходимости для устранения сопутствующих заболеваний и рисков, связанных с лекарствами.
• Симптомы и объективные измерения воспаления (эндоскопические или рентгенологические) должны определять лечение.
• Клиницисты могут увеличивать дозу и комбинировать терапию для повышения эффективности.
• Клиницисты должны оценивать заживление слизистой оболочки каждые шесть месяцев, пока цель не будет достигнута, а затем каждые один-два года, корректируя график в соответствии со степенью обнаруженного воспаления.

Дополнительные вопросы и проблемы

Доктор Лофтус отмечает, что еще нужно ответить на несколько вопросов, чтобы оптимизировать этот алгоритм лечения для пациентов с ВЗК.

«На данный момент нам все еще нужно определить, сколько исцеления действительно требуется для достижения положительных результатов», — объясняет он. «Мы также должны работать, чтобы прояснить степень постепенного исцеления, которого можно достичь путем увеличения дозы или смены терапии. И требуется дополнительная работа, чтобы помочь нам точно определить подходящий временной интервал между изменениями в терапии и последующей переоценкой».

Для получения дополнительной информации

Khanna, R. Ранняя комбинированная иммуносупрессия для лечения болезни Крона (REACT): кластерное рандомизированное контролируемое исследование.Ланцет. 2015; 386: 1825.

ZED1227 предотвращает повышенное повреждение слизистой оболочки при целиакии