Щитовидная железа человека: Клиника Ито

Что такое лекарства для щитовидной железы?

Лечение гормонами щитовидной железы
Левотироксин — это стандарт при заместительной гормональной терапии щитовидной железы и лечении гипотиреоза. Левотироксин (также называемый LT4) эквивалентен форме Т4 природного гормона щитовидной железы и доступен в виде дженериков и фирменных наименований.

Как мне взять левотироксин?
Чтобы оптимизировать всасывание лекарств для щитовидной железы, их следует принимать ежедневно, регулярно запивая водой. Множественные лекарства и добавки снижают абсорбцию гормона щитовидной железы, и их следует принимать с интервалом 3-4 часа, включая добавки кальция и железа, ингибиторы протонной помпы, сою и поливитамины с минералами. Поскольку левотироксин метаболизируется организмом, врач может попросить вас принять дополнительную таблетку или пропустить прием таблетки в некоторые дни недели.Это помогает нам точно подобрать дозу лекарств для вашего организма и требует рекомендаций эндокринолога.

Для пациентов с глютеновой болезнью (аутоиммунное заболевание против глютена) или чувствительностью к глютену доступен состав левотироксина без глютена.

У некоторых людей может быть генетический вариант, который влияет на то, как организм превращает Т4 в Т3, и этим людям может быть полезно добавление небольшой дозы трийодтиронина.

Лиотиронин является заместителем тиреоидного гормона Т3 (трийодтиронин).Это лекарство имеет короткий период полувыведения и его принимают два раза в день или в сочетании с левотироксином. Сам по себе лиотиронин не используется для длительного лечения гипотиреоза.

Другие составы заместителей гормонов щитовидной железы включают натуральных или высушенных экстрактов гормонов щитовидной железы из животных источников. Препараты природного или высушенного экстракта щитовидной железы имеют большую вариабельность доз гормона щитовидной железы между партиями и несбалансированные соотношения, если T4 против T3.Природные или животные источники гормона щитовидной железы обычно содержат 75% Т4 и 25% Т3, по сравнению с нормальным человеческим балансом 95% Т4 и 5% Т3. Лечение с правильным балансом Т4 и Т3 важно для воспроизведения нормальной функции щитовидной железы и предотвращения побочных эффектов избытка Т3, включая остеопороз, проблемы с сердцем, а также нарушения настроения и сна. Эндокринолог может оценить симптомы и тесты щитовидной железы, чтобы сбалансировать прием гормонов щитовидной железы.

Как мне узнать, правильна ли доза для щитовидной железы?

Мониторинг уровней щитовидной железы при приеме лекарств
Правильное дозирование гормона щитовидной железы обычно оценивается с помощью тех же тестов для диагностики заболеваний щитовидной железы, включая ТТГ и FT4.Тесты на щитовидную железу обычно проверяются сначала каждые 4-6 недель, а затем каждые 6-12 месяцев после получения стабильного результата. В особых обстоятельствах, таких как беременность, рак щитовидной железы в анамнезе, центральный гипотиреоз, терапия амиодароном или использование комбинации гормонов щитовидной железы Т4 и Т3, ваш эндокринолог может проверить различные тесты щитовидной железы. Кроме того, ваш эндокринолог оценит симптомы гипертиреоза и гипотиреоза и проведет медицинский осмотр.

Беременные женщины и женщины, которые могут забеременеть , должны лечиться только левотироксином (Т4).Только Т4 эффективно проникает через плаценту, чтобы обеспечить развивающийся плод гормоном щитовидной железы. Гормон щитовидной железы имеет решающее значение для развития мозга на ранних сроках беременности. Нормальные диапазоны тестов щитовидной железы во время беременности различны и меняются в зависимости от триместра. Женщины с заболеванием щитовидной железы во время беременности или планирующие беременность должны находиться под наблюдением эндокринолога для проведения терапии.

Лица с историей рака щитовидной железы, , даже если была удалена только часть щитовидной железы, также имеют разные целевые диапазоны для тестов ТТГ и FT4.Замена гормона щитовидной железы у этих людей тесно связана с постоянным наблюдением за раком щитовидной железы, мониторингом онкомаркеров рака щитовидной железы и динамической оценкой риска рецидива. Эти пациенты находятся под оптимальным контролем мультидисциплинарной команды, включающей эндокринолога и эндокринного хирурга.

Есть вопросы о нормальном уровне гормонов щитовидной железы?

Свяжитесь с нами>

Щитовидная железа — обзор

Хирургическая анатомия

Щитовидная железа представляет собой парный набор аденоматозных желез, расположенных на шее примерно на уровне четвертого-восьмого колец трахеи, латерально, но примыкает к сама трахея (рис.53-1). Правая щитовидная железа обычно расположена немного краниальнее левой железы. С щитовидной железой тесно связаны паращитовидные железы гораздо меньшего размера и бледно-коричневого цвета. На каждой стороне расположены две паращитовидные железы, одна из которых расположена на краниальном полюсе и за пределами паренхимы щитовидной железы (внешняя паращитовидная железа), а вторая каудальная паращитовидная железа находится внутри самой паренхимы щитовидной железы (внутренняя паращитовидная железа). По этой причине во время операции сложнее визуализировать каудальные внутренние паращитовидные железы.

Щитовидные железы инкапсулированы и не имеют протоков. Основным кровоснабжением щитовидной железы является черепная щитовидная артерия, отходящая от общей сонной артерии с каждой стороны. Артерия входит в черепной полюс и разветвляется к паращитовидной железе сразу или в некоторых случаях после прохождения небольшого расстояния через черепной полюс щитовидной железы. Хвостовая артерия щитовидной железы, отходящая от брахицефального ствола, присутствует у некоторых, но не у всех кошек. ² Венозный отток через краниальную и каудальную вены щитовидной железы во внутреннюю яремную вену.

Щитовидные железы у взрослого нормального пациента из семейства кошачьих имеют размеры около 16 мм в длину, 4 мм в ширину и 2 мм в толщину. ³ Паращитовидные железы обычно имеют диаметр около 1–2 мм, при этом краниальные наружные паращитовидные железы хорошо отделены от прилегающей ткани щитовидной железы. У некоторых пациентов из семейства кошачьих может быть перешеек ткани щитовидной железы, соединяющий правую и левую щитовидные железы, ⁴ , хотя это чаще встречается у людей. У кошек также может быть эктопическая ткань щитовидной железы, которая может располагаться в любом месте по средней линии шейной области, грудного входа или, в некоторых случаях, грудной клетки. ⁵ Сообщалось также о кистозной эктопической ткани щитовидной железы на языке. ⁶ Исследования показали, что 10–20% кошек с гипертиреозом, подвергающихся ядерной сцинтиграфии, имеют эктопическую гиперпластическую ткань щитовидной железы. ^7,8 Невозможность идентифицировать гиперпластическую эктопическую ткань щитовидной железы до операции может быть причиной стойкого гипертиреоза после операции. У 50% кошек также может быть эктопическая паращитовидная ткань, которая может располагаться в перитрахеальной фасции, средостении или перикарде. ^2,7,9

Левая щитовидная железа расположена вентрально от пищевода и латеральнее трахеи. Это положение частично отделяет левую щитовидную железу от прямого контакта с левой общей сонной артерией. Медиальнее и немного дорсальнее левой щитовидной железы находится каудальный гортанный нерв, который необходимо защитить во время диссекции. Справа возвратный гортанный нерв расположен немного дорсальнее правой щитовидной железы. Правая общая сонная артерия и правый вагосимпатический ствол расположены латерально.Необходимо соблюдать осторожность, чтобы сохранить эти структуры во время операции. Настоятельно рекомендуется биполярный электрокоагуляционный гемостаз, чтобы кровотечение не мешало хирургу видеть эти структуры.

Возможные последствия для рака щитовидной железы, аутоиммунного тиреоидита и гипотиреоза

Аннотация

Цель

Было высказано предположение, что ртуть и другие токсичные металлы участвуют в заболеваниях щитовидной железы, но распределение и распространенность ртути в щитовидной железе человека неизвестны.Поэтому мы использовали два метода элементарной биовизуализации, чтобы изучить распределение ртути и других токсичных металлов в щитовидной железе людей в широком диапазоне возрастов.

Материалы и методы

Фиксированные формалином блоки ткани щитовидной железы, залитые парафином, были получены от 115 человек в возрасте от 1 до 104 лет с различными клинико-патологическими состояниями, у которых образцы щитовидной железы были взяты во время судебно-медицинской / коронарной аутопсии. Семимикронные срезы этих тканевых блоков были использованы для обнаружения внутриклеточной неорганической ртути с помощью автометаллографии.Присутствие ртути было подтверждено с помощью масс-спектрометрии с лазерной абляцией и индуктивно связанной плазмой, которая может обнаруживать несколько элементов.

Результаты

Ртуть была обнаружена при автометаллографии в фолликулярных клетках щитовидной железы у 4% людей в возрасте 1–29 лет, 9% в возрасте 30–59 лет и 38% в возрасте 60–104 лет. Масс-спектрометрия с лазерной абляцией и индуктивно связанной плазмой подтвердила присутствие ртути в образцах, окрашенных с помощью автометаллографии, и обнаружила кадмий, свинец, железо, никель и серебро в выбранных образцах.

Выводы

Доля людей, содержащих ртуть в фолликулярных клетках щитовидной железы, увеличивается с возрастом, пока она не будет присутствовать у более чем одной трети людей в возрасте 60 лет и старше. Другие токсичные металлы в клетках щитовидной железы могут усиливать токсичность ртути. Ртуть может вызывать генотоксичность, аутоиммунные реакции и окислительное повреждение, что повышает вероятность того, что ртуть может играть роль в патогенезе рака щитовидной железы, аутоиммунного тиреоидита и гипотиреоза.

Образец цитирования: Pamphlett R, Doble PA, Bishop DP (2021) Ртуть в щитовидной железе человека: потенциальные последствия для рака щитовидной железы, аутоиммунного тиреоидита и гипотиреоза.PLoS ONE 16 (2): e0246748. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0246748

Редактор: Джонатан Х. Фридман, Медицинский факультет Университета Луисвилля, США

Поступила: 19 октября 2020 г .; Принята к печати: 25 января 2021 г .; Опубликован: 9 февраля 2021 г.

Авторские права: © 2021 Pamphlett et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в рукописи.

Финансирование: Специального финансирования для этого проекта получено не было. Однако авторы получают следующую поддержку, не относящуюся к данному исследованию: RP поддерживается Мемориалом Эми Стейси и наследством Игнэси Бернетта. PAD поддерживается грантами проекта Discovery Австралийского исследовательского совета DP170100036 и DP1

361. DPB поддерживается премией DE180100194 для начинающих исследователей-исследователей Австралийского исследовательского совета.PAD и DPB поддерживаются грантом Национального института здравоохранения R21AR072950. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Факторы окружающей среды, по оценкам, вносят более 40% в риск рака щитовидной железы [1] и около 25% в риск аутоиммунного тиреоидита [2].Природа этих факторов риска остается в значительной степени неизвестной [3], но одной из тем, представляющих интерес, является возможность того, что тяжелые металлы могут играть роль в заболеваниях щитовидной железы, поскольку щитовидная железа, по-видимому, является мишенью для токсичных металлов из окружающей среды [4, 5]. . Доказательства роли токсичных металлов получены в эпидемиологических и экспериментальных исследованиях, показывающих влияние токсичных металлов на функцию щитовидной железы, при этом большинство исследований посвящено ртути, кадмию и свинцу [4, 6–8]. Однако противоречивые результаты, недостаточно обоснованные эпидемиологические исследования, проблемы с установлением экологических источников воздействия тяжелых металлов и трудности в переводе результатов исследований токсичности животных на воздействие токсичных веществ на человека препятствовали исследованиям в этой области.Исследования на животных показывают, что щитовидная железа крысы, собаки и обезьяны предрасположена к поглощению тяжелых металлов, таких как ртуть [5, 9, 10], но исследования на животных не могут воспроизвести человеческий опыт длительного длительного или повторяющегося воздействия. низкий уровень токсичных металлов, которые биоаккумулируются в тканях. Они также не учитывают потенциальную генетическую предрасположенность человека к токсичности тяжелых металлов [11, 12]. Выявление влияния окружающей среды на заболевания щитовидной железы остается важной темой, особенно с учетом того, что заболеваемость многими из этих заболеваний увеличивается [1, 13–17], что вызывает подозрение, что загрязнители окружающей среды могут способствовать этому увеличению [3].

Имеется немного исследований токсичных металлов в щитовидной железе человека [5, 18, 19]. Уровни ртути в щитовидной железе, взятой на аутопсии, измеренные методом атомной абсорбции, были в пять раз выше у людей с более чем 11 окклюзионными ртутьсодержащими пломбами из амальгамы, чем у людей с менее чем четырьмя такими пломбами [18]. Точно так же уровни ртути в щитовидной железе, взятые при аутопсии, измеренные с помощью масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой, коррелировали с количеством присутствующих поверхностей зубной амальгамы [19].В образцах тканей, отобранных во время операции у эутиреоидных субъектов, уровни таких элементов, как ртуть и кадмий, измеренные с помощью масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой, были выше в щитовидной железе, чем в соседних образцах мышц и жира [5]. В этих исследованиях ткань щитовидной железы должна была быть переварена перед анализом, чтобы элементы не могли быть локализованы в определенных клетках. Это относится к щитовидной железе, поскольку ее фолликулярная архитектура означает, что общая клеточность щитовидной железы низкая, поэтому элементы, присутствующие на низких уровнях или на высоких уровнях только в нескольких клетках, трудно обнаружить.

Чтобы получить более четкое представление о роли токсичных металлов в заболеваниях щитовидной железы, мы разработали проект с двумя отличиями от предыдущих исследований. Во-первых, мы использовали два метода элементарной биовизуализации, которые позволили нам изучить клеточное распределение ртути и других токсичных металлов в срезах щитовидной железы человека. Во-вторых, мы проанализировали образцы щитовидной железы, полученные при аутопсии, у людей со спектром клинико-патологических состояний и из широкого диапазона возрастов, из чего мы могли оценить распространенность ртутьсодержащих щитовидной железы и влияние старения на содержание ртути в организме. щитовидная железа.

Материалы и методы

Этика

Это исследование (X14-029) было одобрено Комитетом по исследованиям на людях местного округа здравоохранения Сиднея (зона больницы королевского принца Альфреда). Этот институциональный наблюдательный совет отказался от необходимости в письменном информированном согласии родственников исследуемых лиц, поскольку это было анонимное ретроспективное исследование архивной залитой парафином ткани. Данные были полностью анонимными в исследовательской базе данных после первоначального доступа к записям Департамента судебной медицины.

Сбор проб

залитых парафином блоков ткани щитовидной железы были получены из архива тканей Департамента судебной медицины Нового Южного Уэльса. Они были взяты как часть стандартного отбора образцов тканей при вскрытии 115 человек (68 мужчин, 47 женщин) со средним возрастом 54 года, средним возрастом 47 лет, возрастным диапазоном 1–104 года и SD 27 лет ( лет). Таблица 1 ). Основными заболеваниями были: неизвестное (N = 50), нейродегенеративное заболевание (N = 33), психоз (N = 27), эпилепсия (N = 2) и по одному от нервной анорексии, рака и синдрома Дауна.Причинами смерти были: самоубийство (N = 26), травмы (N = 17), утопление (N = 16), сердечно-сосудистые заболевания (N = 14), передозировка наркотиков (N = 14), инфекция (N = 8), неустановленные ( N = 6), удушье (N = 5), цереброваскулярное вмешательство (N = 3), рак (N = 2) и по одному: гипотермия, дыхательная недостаточность, внезапная неожиданная смерть от эпилепсии и недоедание.

Автометаллография

Парафиновые блоки были разрезаны на срезы 7 мкм одноразовым лезвием микротома из нержавеющей стали Feather S35 и депарафинизированы.Срезы окрашивали на наличие неорганической ртути с помощью автометаллографии нитрата серебра, которая представляет присутствие ртути в виде черных серебряных зерен, окружающих ртуть [20]. Автометаллография — это чувствительный метод амплификации, позволяющий обнаружить в клетке всего 10 молекул сульфида / селенида ртути [21]. Вкратце, срезы помещали в физический проявитель, содержащий 50% гуммиарабика, цитратный буфер, гидрохинон и нитрат серебра, при 26 ° C в течение 80 минут в темноте, затем промывали 5% тиосульфатом натрия для удаления несвязанного серебра.Срезы контрастировали гематоксилином, не содержащим ртути, и просматривали с помощью светлопольной микроскопии. Каждый запуск окрашивания включал контрольный срез спинного мозга мыши, где тела клеток двигательных нейронов содержали ртуть после внутрибрюшинной инъекции хлорида ртути, с заархивированными парафиновыми блоками, использованными в предыдущем эксперименте, одобренном Комитетом по этике животных Сиднейского университета [22]. Срезы окрашивали гематоксилином только для того, чтобы действовать в качестве контроля для срезов, окрашенных автометаллографией, чтобы убедиться, что любые черные зерна, видимые на автометаллографии, а не от меланиноподобного пигмента, который иногда можно увидеть в фолликулярных клетках [23].Окрашивание щитовидной железы при автометаллографии было классифицировано как: 0: отсутствие AMG-положительных фолликулярных клеток, +: AMG-положительные фолликулярные клетки, но менее пяти фолликулов с 50% или более AMG-положительных клеток, или ++: не менее пяти фолликулов с 50% или более AMG-положительных клеток.

Масс-спектрометрия с лазерной абляцией и индуктивно связанной плазмой (LA-ICP-MS)

Чтобы подтвердить, какие металлы демонстрирует автометаллография (поскольку автометаллография может также обнаруживать неорганическое серебро и висмут), и для поиска присутствия других токсичных металлов, парафиновые срезы 7 мкм отобранных образцов щитовидной железы были депарафинированы и подвергнуты LA-ICP-MS для определения ртути. , серебро, висмут, алюминий, золото, кадмий, хром, железо, никель и свинец, а также фосфор (содержащийся в ядрах клеток) для оценки плотности клеток.Анализы проводились на лазере New Wave Research NWR-193 или лазере Teledyne Cetac LSX-213 G2 +, подключенном к Agilent Technologies 7700x ICP-MS, с аргоном в качестве газа-носителя. Условия LA-ICP-MS были оптимизированы на NIST 612 Trace Element in Glass CRM, и образец был подвергнут абляции с размером пятна 50 мкм и скоростью сканирования 100 мкм / с при частоте 20 Гц. Данные были собраны в единый файл изображения с использованием программного обеспечения собственной разработки и визуализированы с помощью FIJI.

Статистический анализ

Prism v8.Программное обеспечение 4 использовалось для анализа хи-квадрат с точным критерием Фишера для сравнения категориальных переменных, анализа хи-квадрат для выявления тенденций для поиска возрастных эффектов в группах и t-критериев для сравнения непрерывных переменных. Достоверность оценивалась на уровне 0,05.

Результаты

Автометаллография

Окрашенные ртутью черные зерна были обнаружены в цитоплазме фолликулярных клеток в 22 из 115 (19%) образцов, 15 — с категорией + и 7 — с автометаллографией категории ++ (последние все старше 70 лет) ( Рис. Таблица 1 ).Плотность окрашивания ртутью в отдельных фолликулярных клетках варьировалась в пределах и между образцами. Доля фолликулярных клеток, содержащих ртуть, также варьировалась как в образцах, так и между образцами.

Рис. 1. Окрашивание ртутью щитовидной железы.

Вставки — увеличенные изображения прямоугольников, обозначенных пунктирной линией. ( A ) Плотные зерна ртути (например, стрелка на вставке) присутствуют в большинстве клеток этих фолликулов щитовидной железы (T81). ( B ) Другая область щитовидной железы в образце A показывает зерна ртути только в нескольких разбросанных фолликулярных клетках (например, наконечник стрелки), показывая вариабельность поглощения ртути в различных областях щитовидной железы (T81).( C) Черные зерна ртути (например, стрелка) видны менее чем в 50% фолликулярных клеток в этой щитовидной железе (T87). ( D ) Множественные мелкие зерна ртути (например, наконечник стрелки) присутствуют в большинстве клеток этого фолликула (T23). ( E ) В некоторых фолликулах наблюдалась смесь клеток, содержащих ртуть (стрелка, слева) и липофусцин (например, стрелка, справа) (T103). ( F ) В клетках (например, наконечнике стрелки) этих фолликулов (T97) не наблюдается черных зерен ртути. Автометаллография / гематоксилин.T: идентификационный номер образца (см. Таблицу 1).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0246748.g001

Доля людей с ртутью в щитовидной железе

Доля людей с ртутью в фолликулярных клетках щитовидной железы составляла 4% в возрастном диапазоне 1-29 лет, 9% в возрастном диапазоне 30-59 лет и 38% в возрастном диапазоне 60-104 лет (тенденция p < 0,0001) ( Рис 2 ). Средний возраст людей с ртутью в фолликулярных клетках щитовидной железы был выше (средний возраст 71 год, стандартное отклонение 20 лет, диапазон от 29 до 98 лет), чем у людей без ртути (средний возраст 50 лет, стандартное отклонение 28 лет, диапазон 1-104 года) (p = 0.001). Доля образцов щитовидной железы, содержащих ртуть, не различалась между мужчинами (12 из 68, 18%) и женщинами (10 из 37, 21%) (p = 0,64), несмотря на то, что женщины имели более высокий средний возраст (61 год, SD 30 лет), чем мужчины (49 лет, стандартное отклонение 25 лет) (p = 0,028). Для проведения надежного статистического анализа содержания ртути в щитовидной железе в этих подгруппах было недостаточно количеств в подгруппах предубойных заболеваний или причин смерти.

Рис. 2. Доля людей с фолликулярными клетками, содержащими ртуть.

При автометаллографии ртуть была обнаружена в фолликулярных клетках щитовидной железы 4% людей в возрасте от 1 до 29 лет, 9% людей в возрасте от 30 до 59 лет и 38% людей в возрасте от 60 до 104 лет. Цифры над полосами = числа в возрастных группах.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0246748.g002

LA-ICP-MS

Изображения фосфора

LA-ICP-MS демонстрируют ядра клеток и очерчивают фолликулярную архитектуру щитовидной железы ( Рис. 3 ).Таким образом, металлы, такие как ртуть и кадмий, могут быть локализованы в фолликулярных клетках с помощью LA-ICP-MS (, рис. 3, ). Изображения с помощью LA-ICP-MS показали наличие ртути в фолликулярных клетках во всех трех пробах щитовидной железы с положительным результатом автометаллографии ( рис. Рис 5, таблица 2 ). Помимо ртути, в шести образцах LA-ICP-MS были обнаружены четыре других потенциально токсичных металла ( рис. 4 и 5, таблица 2 ): фолликулярный кадмий был обнаружен во всех шести образцах, железо в пяти образцах, свинец в четырех образцах. , и никель в двух образцах.Некоторое количество фонового серебра было обнаружено в двух образцах. Хром, алюминий, висмут и золото не обнаружены ни в одном образце.

Рис. 3. Локализация ртути и кадмия с помощью LA-ICP-MS.

Этот образец (Т40) показал автометаллографическое окрашивание большинства фолликулов щитовидной железы. ( A ) Фосфорное изображение ядер клеток демонстрирует фолликулярную архитектуру щитовидной железы. Закрашенная стрелка показывает пример одного целого фолликула. Открытая стрелка показывает клетки на одном крае фолликула.( B ) Ртуть присутствует в большинстве фолликулярных клеток. ( C ) Кадмий присутствует в разбросанных фолликулярных клетках. Масштаб = количество импульсов в секунду (пропорционально численности). T: идентификационный номер образца (см. Таблицу 1).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0246748.g003

Рис. 4. LA-ICP-MS AMG-положительных образцов щитовидной железы.

Изображения фосфора показывают клеточность образцов. (A) Фолликулярные клетки содержат ртуть, кадмий, свинец, железо и никель (T40). (B) Фолликулярные клетки содержат ртуть, кадмий и железо (T86). (C) Фолликулярные клетки содержат ртуть, кадмий и железо (T91). Маленькие дискретные красные точки, например, на изображении отведений в B, связаны с загрязнением поверхности. Артефактный эффект края никеля виден на C. Масштаб = количество импульсов в секунду (пропорционально численности). T: идентификационный номер образца (см. Таблицу 1).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0246748.g004

Рис. 5. LA-ICP-MS AMG-отрицательных образцов щитовидной железы.

Изображения фосфора показывают клеточность образцов. (A) Кадмий, свинец и железо присутствуют в фолликулярных клетках (T97). (B) Кадмий, свинец и железо (спорадически) присутствуют в фолликулярных клетках (T45). (C) Фолликулярные клетки содержат кадмий, свинец, железо и никель (T70). Масштаб = количество импульсов в секунду (пропорционально численности). T: идентификационный номер образца (см. Таблицу 1).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0246748.g005

Обсуждение

Ключевым выводом этого исследования является то, что ртуть обычно присутствует в фолликулярных клетках щитовидной железы взрослого человека, что повышает вероятность того, что ртуть может способствовать развитию ряда заболеваний щитовидной железы ( S1, рис. ).Другие токсичные металлы, такие как кадмий и свинец, также обнаруживаются в щитовидной железе человека, что позволяет предположить, что синергические взаимодействия между токсичными металлами могут усилить токсичность ртути в клетках щитовидной железы [24].

Нам не удалось выяснить, почему обычно только некоторые фолликулярные клетки содержат ртуть, но эта вариабельность клеточной ртути, по-видимому, обычна в тканях человека, таких как мозг [25], гипофиз [26], поджелудочная железа [27] и грудь [28]. . Следует отметить, что фолликулярные клетки в одном фолликуле могут быть уплощенными с одной стороны и кубовидными или столбчатыми с другой, что указывает на наличие функциональной полярности [23].Теоретически в основе этой изменчивости может лежать либо повышенное поглощение ртути, либо ее снижение в подмножествах фолликулярных клеток. Будущие исследования автометаллографии в сочетании с иммуногистохимией для ряда переносчиков ртути как в клетки, так и из них [29, 30] будут необходимы, чтобы увидеть, лежит ли вариабельность этих клеточных переносчиков в основе неоднородного присутствия ртути в фолликулярных клетках.

Токсичные тяжелые металлы, такие как ртуть, могут вызывать различные заболевания щитовидной железы, поскольку ртуть может инициировать пути, ведущие к генетическим мутациям [31, 32], аутоиммунным реакциям [33] и продукции свободных радикалов кислорода [34, 35], механизмы, которые предположительно лежат в основе патогенез рака щитовидной железы [36], аутоиммунного тиреоидита [37] и гипотиреоза [38].Ртуть обладает генотоксическими свойствами, которые могут способствовать образованию мутаций, вызывающих рак [31, 32]. Стволовые клетки щитовидной железы мыши содержат переносчик ртути ABCG2 / BCRP, что свидетельствует о том, что стволовые клетки щитовидной железы (но не фолликулярные клетки, в которых отсутствует ABCG2 / BCRP) адаптировались к поглощению ртути и прилагают усилия, чтобы избавиться от этого металла [39, 40]. Ртуть является известным промотором аутоиммунных реакций [33, 41], поэтому, когда количество ртути в фолликулярных клетках щитовидной железы достигает критического уровня у людей с генетической предрасположенностью к аутоиммунитету, может возникнуть аутоиммунный тиреоидит [42, 43].Считается, что некоторые случаи гипотиреоза возникают в результате субклинического аутоиммунного тиреоидита [38], и образование свободных радикалов кислорода ртутью [35] является еще одним механизмом, с помощью которого этот металл может способствовать пониженной активности щитовидной железы [44]. Доказательства связи между ртутью в фолликулярных клетках щитовидной железы и окислительным стрессом можно найти, комбинируя автометаллографию с гистохимическим маркером окислительного повреждения нуклеиновых кислот [45]. Связь между аутоиммунным тиреоидитом и раком щитовидной железы была отмечена несколькими исследователями с предположением, что рак может возникнуть в результате хронического воспаления тиреоидита [46, 47]; Наше открытие ртути в фолликулярных клетках предполагает, что токсичность ртути, лежащая в основе обоих заболеваний, может быть еще одной причиной, по которой эти два заболевания часто сосуществуют.

Сообщалось о повышении со временем заболеваемости раком щитовидной железы, аутоиммунным тиреоидитом и гипотиреозом [1, 13–17]. Количество ртути в глобальной атмосфере увеличилось с 1950 года [48], в основном из-за сжигания угля [49]. Атмосферная ртуть попадает в воду, а затем в морепродукты, особенно в хищных рыбах, где уровень ртути в тканях растет [50]. Потребление рыбы является наиболее частой причиной воздействия ртути на человека [51], и наши выводы о том, что ртуть часто присутствует в клетках щитовидной железы, позволяют предположить, что этот металл является кандидатом на объяснение возрастающей частоты различных заболеваний щитовидной железы.

Из металлов, не содержащих ртуть, обнаруженных в щитовидной железе, кадмий был наиболее распространенным, поскольку он присутствовал в фолликулярных клетках всех образцов LA-ICP-MS. Кадмий — это известный генотоксин, который участвует в развитии рака щитовидной железы [52] и оказывает разрушающее действие на эндокринную систему, что может влиять на функцию щитовидной железы [8]. Сигаретный дым является основным источником воздействия кадмия на людей, но курение, по-видимому, снижает, а не увеличивает риск рака щитовидной железы [1], с противоречивыми данными о его роли как фактора риска аутоиммунного тиреоидита [3, 42, 53] и гипотиреоз [3, 7, 53].Хотя из наших изображений LA-ICP-MS представляется вероятным, что ртуть и кадмий совместно расположены в некоторых фолликулярных клетках, мы не можем быть уверены в этом, поскольку размер пятна для LA-ICP-MS составляет 50 мкм, что больше чем типичная кубовидная фолликулярная клетка (около 10 мкм, см. рис. 1F). Другими металлами, обнаруженными в щитовидной железе с помощью LA-ICP-MS, были свинец, железо, никель и серебро. Исследования связи гормонов щитовидной железы человека и воздействия свинца дали противоречивые результаты [7], а метаанализ не предоставил доказательств того, что воздействие свинца на производстве влияет на функцию щитовидной железы [54].Однако свинец может рекрутировать антитела, которые атакуют щитовидную железу [55], и может играть роль в аутоиммунном тиреоидите [56] и коллоидном зобе [57]. Железо является важным металлом, но в больших количествах, например, при гемохроматозе, оно может вызывать гипотиреоз с помощью антитиреоидных антител [58]. Системная аллергия на никель может привести к аутоиммунной реакции у людей, у которых есть никель в клетках щитовидной железы [59]. Наночастицы серебра могут вызывать окислительный стресс в клетках [60]. Наконец, все эти металлы могут взаимодействовать с ртутью, повышая токсичность клеток щитовидной железы [24].

Воздействие токсичных металлов окружающей среды на человека является обычным явлением, поэтому вполне вероятно, что необходимы другие факторы риска для взаимодействия с токсикантами металлов до того, как будут повреждены клетки щитовидной железы. Некоторые метаболические процессы защищают клетки от токсичных металлов, и были идентифицированы генетические варианты, влияющие на белки в этих путях, которые могут повышать восприимчивость к металлам, таким как ртуть [11]. Селен детоксифицирует ртуть в клетках, а низкие уровни селена связаны с аутоиммунитетом щитовидной железы, раком и коллоидным зобом [56, 57, 61, 62].Однако в нашем исследовании нет доказательств того, что уровни внутриклеточного селена в фолликулах были низкими, поскольку LA-ICP-MS не является чувствительным методом обнаружения селена, и гистологические методы не доступны для обнаружения этого элемента.

Это исследование имеет несколько ограничений. ( 1 ) В нашей серии судебно-медицинских / корональных вскрытий были представлены образцы щитовидной железы людей различного возраста и различных клинических патологических состояний. Однако ни одна серия вскрытий не может точно воспроизвести данные о распространенности среди живого населения.( 2 ) У нас не было достаточно клинической информации, чтобы знать, имел ли кто-либо из участников нашего исследования клиническое заболевание щитовидной железы. Будущие проспективные элементные исследования ткани щитовидной железы у людей с клиническими данными, исследованиями функции щитовидной железы и аутоантителами щитовидной железы потребуются для корреляции индивидуальных заболеваний щитовидной железы с содержанием металлов в щитовидной железе. ( 3 ) Перспективные биохимические и геномные исследования in vivo потребуются для изучения роли дефицита селена и генетической предрасположенности как факторов чувствительности к токсичности металлов в щитовидной железе.( 4 ) Никто из исследуемой популяции не болел раком щитовидной железы. Будущее исследование, посвященное содержанию тяжелых металлов в структурно нормальной ткани щитовидной железы, прилегающей к раку щитовидной железы, как это было предпринято для рака груди и ртути [28], будет необходимо для определения того, чаще ли генотоксичные металлы обнаруживаются в ткани щитовидной железы у людей с по сравнению с людьми без рака щитовидной железы. ( 5 ) Нам не удалось определить, почему ртуть избирательно проникает в фолликулярные клетки щитовидной железы.Присутствие сульфгидрильных групп и металлотионеина в клетках щитовидной железы, которые связывают такие металлы, как ртуть и кадмий, может быть одним из факторов накопления и сохранения этих металлов в клетках щитовидной железы. Дальнейшие исследования токсичных металлов в щитовидной железе и их связи с содержанием сульфгидрильных групп в щитовидной железе и экспрессией металлотионеина могут предоставить больше информации по этому вопросу. ( 6 ) Автометаллография может обнаруживать только неорганическую ртуть, но поскольку это, по-видимому, ближайшая токсичная форма ртути в клетках [63], ее форма является наиболее важной для идентификации.

В заключение, ртуть обычно содержится в фолликулярных клетках щитовидной железы человека, доля людей, имеющих ртуть в фолликулярных клетках щитовидной железы, увеличивается с возрастом, а другие токсичные металлы, такие как кадмий, часто обнаруживаются в щитовидной железе. Многие токсичные металлы обладают повреждающим действием, что может способствовать патогенезу рака щитовидной железы, аутоиммунного тиреоидита и гипотиреоза. Большинство эффектов токсичных металлов на щитовидную железу человека остаются гипотетическими ( S1, рис. ), поэтому в будущих перспективных экспериментах, связанных с корреляцией присутствия токсичных металлов в щитовидной железе со специфическими заболеваниями щитовидной железы, необходимо будет пролить свет на роль токсичных металлов, таких как ртуть. играть в заболеваниях щитовидной железы.

Дополнительная информация

S1 Рис. Гипотетический путь, показывающий, как ртуть и другие токсичные металлы могут увеличивать риск заболеваний щитовидной железы.

Воздействие ртути на человека в результате (1) потребления морской или пресноводной рыбы, ракообразных и моллюсков, (2) профессии или (3) зубных пломб из амальгамы, приводит к отложению неорганической или метилртути в фолликулярных клетках щитовидной железы. Метилртуть медленно превращается в неорганическую ртуть в клетках. Токсичность ртути может быть усилена генетической предрасположенностью, дефицитом селена или присутствием других токсичных металлов.После биоаккумуляции критический внутриклеточный уровень ртути может вызвать генетические мутации, вызывающие рак, аутоиммунные реакции, вызывающие тиреоидит и гипотиреоз, и окислительное повреждение, способствующее дальнейшему развитию гипотиреоза.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0246748.s001

(TIF)

Ссылки

1. 1. Китахара CM, Соса JA. Изменение заболеваемости раком щитовидной железы. Nat Rev Endocrinol. 2016; 12: 646–653. pmid: 27418023
2. 2.Hansen PS, Brix TH, Iachine I, Kyvik KO, Hegedus L. Относительная важность генетических и экологических эффектов на ранних стадиях аутоиммунитета щитовидной железы: исследование здоровых датских близнецов. Eur J Endocrinol. 2006; 154: 29–38. pmid: 16381988
3. 3. Феррари С.М., Фаллахи П., Антонелли А., Бенвенга С. Экологические проблемы при заболеваниях щитовидной железы. Фронт-эндокринол (Лозанна). 2017; 8:50 pmid: 28373861
4. 4. Rana SV. Перспективы эндокринной токсичности тяжелых металлов — обзор.Biol Trace Elem Res. 2014; 160: 1–14. pmid: 24898714
5. 5. Маландрино П., Руссо М., Ронки А., Моретти Ф., Джани Ф., Виньери П. и др. Концентрация металлов и микроэлементов в нормальной щитовидной железе человека и крысы: сравнение с мышечной и жировой тканью и вулканическими и контрольными областями. Щитовидная железа. 2020; 30: 290–299. pmid: 31880996
6. 6. Чжу X, Кусака Y, Сато К., Чжан К. Эндокринные разрушительные эффекты ртути. Environ Health Prev Med. 2000. 4: 174–183.pmid: 21432482
7. 7. Чен А., Ким С.С., Чанг Э., Дитрих К.Н. Гормоны щитовидной железы в связи с воздействием свинца, ртути и кадмия в Национальном обследовании здоровья и питания, 2007–2008 гг. Перспектива здоровья окружающей среды. 2013; 121: 181–186. pmid: 23164649
8. 8. Буха А., Матович В., Антониевич Б., Булат З., Курчич М., Реньери Е.А. и др. Обзор эффектов и механизмов нарушения функции щитовидной железы кадмия. Int J Mol Sci. 2018; 19. pmid: 29772829
9. 9. Хансен Дж. К., Реске-Нильсен Э., Торласиус-Уссинг О, Рунгби Дж., Даншер Г.Распределение ртути в рационе собаки. Количественное определение и локализация общей ртути в органах и центральной нервной системе. Sci Total Environ. 1989; 78: 23–43. pmid: 2717923
10. 10. Хаят А., Денкер Л. Распределение вдыхаемой металлической ртути в органах и клетках у крыс и мартышек (Callithrix jacchus): влияние предварительной обработки этиловым спиртом. Acta Pharmacol Toxicol (Копен). 1984. 55: 145–152. pmid: 6437142
11. 11. Андреоли В, Спровьери Ф.Генетические аспекты восприимчивости к токсичности ртути: обзор. Int J Environ Res Public Health. 2017; 14: E93. pmid: 28106810
12. 12. Joneidi Z, Mortazavi Y, Memari F, Roointan A, Chahardouli B, Rostami S. Влияние генетической изменчивости на метаболизм тяжелых металлов: генетическая предрасположенность? Biomed Pharmacother. 2019; 113: 108642. pmid: 30849640
13. 13. Лиз Г.П., Флинн Р.В., Юнг Р.Т., Макдональд TM, Мерфи М.Дж., Моррис А.Д. Растущая распространенность и заболеваемость заболеваниями щитовидной железы в Тейсайде, Шотландия: аудит эпидемиологии щитовидной железы и научное исследование (TEARS).Клин Эндокринол (Oxf). 2008. 68: 311–316. pmid: 17970771
14. 14. Vanderpump MP. Эпидемиология заболеваний щитовидной железы. Br Med Bull. 2011; 99: 39–51. pmid: 21893493
15. 15. Маклеод Д.С., Купер Д.С. Заболеваемость и распространенность аутоиммунных заболеваний щитовидной железы. Эндокринная. 2012; 42: 252–265. pmid: 22644837
16. 16. Виньери Р., Маландрино П., Руссо М. Увеличивается ли заболеваемость и агрессивность рака щитовидной железы? J Clin Endocrinol Metab. 2020; 105. pmid: 32369832
17. 17.Ким Дж., Госнелл Дж. Э., Роман С.А. Географические факторы глобального роста рака щитовидной железы. Nat Rev Endocrinol. 2020; 16: 17–29. pmid: 31616074
18. 18. Guzzi G, Grandi M, Cattaneo C, Calza S, Minoia C, Ronchi A и др. Стоматологическая амальгама и уровни ртути в тканях вскрытия: пища для размышлений. Am J Forensic Med Pathol. 2006; 27: 42–45. pmid: 16501347
19. 19. Bjorkman L, Lundekvam BF, Laegreid T, Bertelsen BI, Morild I, Lilleng P и др. Ртуть в мозге, крови, мышцах и ногтях человека в зависимости от воздействия: исследование вскрытия.Здоровье окружающей среды. 2007; 6:30 pmid: 17931423
20. 20. Даншер Г., Моллер-Мадсен Б. Серебряное усиление сульфида и селенида ртути: гистохимический метод световой и электронной микроскопии локализации ртути в ткани. J Histochem Cytochem. 1985. 33: 219–228. pmid: 2579122
21. 21. Danscher G, Rungby J. Дифференциация ртути и серебра, визуализированных гистохимически. Histochem J. 1986; 18: 109–114. pmid: 3733462
22. 22. Брошюра R, Png FY.Уменьшение моторных аксонов вследствие системного воздействия неорганической ртути. J Neuropathol Exp Neurol. 1998. 57: 360–366. pmid: 9600230
23. 23. Carcangiu ML (1997) Thyroid. В: Штернберг С.С., редактор. Гистология для патологов. 2-е изд. Филадельфия: Липпинкотт-Рэйвен. С. 1075–1092.
24. 24. Андраде В.М., Ашнер М., Маррейла душ Сантуш А.П. (2017) Нейротоксичность смесей металлов. В: Aschner M, Costa LG, редакторы. Нейротоксичность металлов. 2017/09/11 изд. Чам, Швейцария: Springer Nature.С. 227–265.
25. 25. Брошюра Р., Мак Р., Ли Дж., Бакленд М.Э., Хардинг А.Дж., Кум Еврей С. и др. Концентрации токсичных металлов и основных микроэлементов варьируются между отдельными нейронами в голубом локусе человека. PLoS One. 2020; 15: e0233300. pmid: 32428015
26. 26. Брошюра Р., Кум Еврей С., Добл П.А., Епископ Д.П. Элементный анализ старения гипофиза человека указывает на то, что ртуть является одной из причин соматопаузы. Фронт-эндокринол (Лозанна). 2019; 10: 419.pmid: 31297094
27. 27. Pamphlett R, Colebatch AJ, Doble PA, Bishop DP. Ртуть в клетках поджелудочной железы людей с раком поджелудочной железы и без него. Int J Environ Res Public Health. 2020; 17. pmid: 33276658
28. 28. Брошюра Р., Сатгунасилан Л., Кум Еврей С., Добл П.А., Епископ Д.П. Элементная биовизуализация показывает ртуть и другие токсичные металлы в нормальной ткани груди и при раке груди. PLoS One. 2020; 15: e0228226. pmid: 32004334
29. 29. Мосты ЦК, Залупс РК.Механизмы, участвующие в транспорте ионов ртути в тканях-мишенях. Arch Toxicol. 2017; 91: 63–81. pmid: 27422290
30. 30. Maliepaard M, Scheffer GL, Faneyte IF, van Gastelen MA, Pijnenborg AC, Schinkel AH, et al. Субклеточная локализация и распределение переносчика белка устойчивости к раку молочной железы в нормальных тканях человека. Cancer Res. 2001; 61: 3458–3464. pmid: 11309308
31. 31. Креспо-Лопес М.Э., Маседо Г.Л., Перейра С.И., Аррифано Г.П., Пиканко-Диниз Д.Л., до Насименто Дж.Л. и др.Ртуть и генотоксичность человека: важные соображения и возможные молекулярные механизмы. Pharmacol Res. 2009. 60: 212–220. pmid: 19446469
32. 32. Нерсесян А., Кунди М., Вальдхерр М., Сетайеш Т., Мисик М., Вульч Г. и др. Результаты анализа микроядер у лиц, которые профессионально и экологически подвергаются воздействию ртути, свинца и кадмия. Mutat Res. 2016; 770: 119–139. pmid: 27894681
33. 33. Поллард К.М., Кауви Д.М., Туми С.Б., Халтман П., Коно Д.Х. Воспаление, вызванное ртутью, и аутоиммунитет.Biochim Biophys Acta Gen Subj. 2019; 1863: 129299. pmid: 30742953
34. 34. Поллард К.М., Халтман П., Коно Д.Х. Токсикология аутоиммунных заболеваний. Chem Res Toxicol. 2010. 23: 455–466. pmid: 20078109
35. 35. Tchounwou PB, Yedjou CG, Patlolla AK, Sutton DJ. Токсичность тяжелых металлов и окружающая среда. Exp Suppl. 2012; 101: 133–164. pmid: 22945569
36. 36. Виньери Р., Маландрино П., Виньери П. Меняющаяся эпидемиология рака щитовидной железы: почему растет заболеваемость? Curr Opin Oncol.2015; 27: 1–7. pmid: 25310641
37. 37. Perga S, Martire S, Montarolo F, Giordani I, Spadaro M, Bono G и др. Следы полиаутоиммунитета: доказательства общих биологических факторов, участвующих в рассеянном склерозе и тиреоидите Хашимото. Фронт Иммунол. 2018; 9: 311. pmid: 29527211
38. 38. Чакер Л., Бьянко А.С., Йонклаас Дж., Петерс Р.П. Гипотиреоз. Ланцет. 2017; 390: 1550–1562. pmid: 28336049
39. 39. Хоши Н., Кусакабе Т., Тейлор Б.Дж., Кимура С.Клетки боковой популяции в щитовидной железе мыши обладают характеристиками, подобными стволовым клеткам / клеткам-предшественникам. Эндокринология. 2007. 148: 4251–4258. pmid: 17584961
40. 40. Мато Е., Гонсалес С., Морал А., Перес Дж. И., Белл О., Лерма Е. и др. Экспрессия гена ABCG2 / BCRP связана с генами индуктора эпителиально-мезенхимального перехода в клеточной линии папиллярной карциномы щитовидной железы (TPC-1). J Mol Endocrinol. 2014; 52: 289–300. pmid: 24643400
41. 41. Макбул Ф., Ниаз К., Хассан Ф.И., Хан Ф., Абдоллахи М.Иммунотоксичность ртути: патологические и токсикологические эффекты. J Environ Sci Health C Environ Carcinog Ecotoxicol Rev.2017; 35: 29–46. pmid: 28055311
42. 42. Саранац Л., Живанович С., Бжелакович Б., Стаменкович Н., Новак М., Каменов Б. Почему щитовидная железа так подвержена аутоиммунным заболеваниям? Horm Res Paediatr. 2011; 75: 157–165. pmid: 21346360
43. 43. Duntas LH. Факторы окружающей среды и аутоиммунный тиреоидит. Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 2008. 4: 454–460.pmid: 18607401
44. 44. Манчини А., Ди Сеньи С., Раймондо С., Оливьери Дж., Сильвестрини А., Меуччи Е. и др. Гормоны щитовидной железы, окислительный стресс и воспаление. Медиаторы Inflamm. 2016; 2016: 6757154. pmid: 27051079
45. 45. Памфлетт Р., Слейтер М., Томас С. Окислительное повреждение нуклеиновых кислот в двигательных нейронах, содержащих ртуть. J Neurol Sci. 1998. 159: 121–126. pmid: 9741394
46. 46. Нурелдин С.И., Туфано Р.П. Ассоциация тиреоидита Хашимото и рака щитовидной железы.Curr Opin Oncol. 2015; 27: 21–25. pmid: 253
47. 47. Резенде де Пайва С., Гронхой С., Фельдт-Расмуссен Ю., фон Бухвальд С. Связь между тироидитом Хашимото и раком щитовидной железы у 64 628 пациентов. Фасад Онкол. 2017; 7: 53. pmid: 28443243
48. 48. Streets DG, Devane MK, Lu Z, Bond TC, Sunderland EM, Jacob DJ. Постоянные выбросы ртути в атмосферу в результате деятельности человека. Environ Sci Technol. 2011; 45: 10485–10491. pmid: 22070723
49. 49.Streets DG, Lu Z, Levin L, Ter Schure AFH, Sunderland EM. Исторические выбросы ртути в воздух, землю и воду в результате сжигания угля. Sci Total Environ. 2018; 615: 131–140. pmid: 28964988
50. 50. Лавуа Р.А., Буффар А., Марангер Р., Амиот М. Перенос ртути и воздействие на человека в результате глобального морского рыболовства. Sci Rep.2018; 8: 6705. pmid: 29712952
51. 51. Карими Р., Зильбернагель С., Фишер Н.С., Меликер-младший. Повышенный уровень Hg в крови при рекомендованных нормах потребления морепродуктов у взрослых потребителей морепродуктов.Int J Hyg Environ Health. 2014; 217: 758–764. pmid: 24780236
52. 52. Маротта В., Маландрино П., Руссо М., Панариелло И., Ионна Ф., Чиофало М.Г. и др. Понимание связи между антропогенным химическим загрязнением и раком щитовидной железы. Crit Rev Oncol Hematol. 2020; 150: 102950. pmid: 32339980
53. 53. Kim SJ, Kim MJ, Yoon SG, Myong JP, Yu HW, Chai YJ, et al. Влияние курения на щитовидную железу: дозозависимое влияние уровней котинина в моче на функцию щитовидной железы и аутоиммунитет щитовидной железы.Sci Rep.2019; 9: 4213. pmid: 30862792
54. 54. Krieg EF Jr. Метаанализ исследований, изучающих влияние профессионального воздействия свинца на гормоны щитовидной железы. Am J Ind Med. 2016; 59: 583–590. pmid: 27094769
55. 55. Не Икс, Чен И, Чен И, Чен Ц, Хан Б., Ли Кью и др. Воздействие свинца и кадмия, более высокие антитела к щитовидной железе и дисфункция щитовидной железы у китаянок. Загрязнение окружающей среды. 2017; 230: 320–328. pmid: 28667913
56. 56. Стойсавлевич А., Ровчанин Б., Ягодич Дж., Радойкович Д.Д., Паунович И., Гаврович-Янкулович М. и др.Значимость мышьяка и свинца при тиреоидите Хашимото продемонстрирована на образцах ткани щитовидной железы, крови и мочи. Environ Res. 2020; 186: 109538. pmid: 32334172
57. 57. Стойсавлевич А., Ровчанин Б., Ягодич Дж., Боркович-Митич С., Паунович И., Диклич А. и др. Оценка риска токсичных и незаменимых микроэлементов для здоровья щитовидной железы на тканевом уровне: значение свинца и селена для заболевания коллоидным зобом. Выставка Здоровье. 2020; 12: 255–264.
58. 58. Эдвардс CQ, Kelly TM, Ellwein G, Kushner JP.Заболевания щитовидной железы при гемохроматозе. Повышенная заболеваемость у гомозиготных мужчин. Arch Intern Med. 1983; 143: 1890–1893. pmid: 6625774
59. 59. Андриоли М., Тримболи П., Майо Д., Персани Л., Минелли М. Системный аллергический синдром никеля как иммуноопосредованное заболевание с повышенным риском аутоиммунитета щитовидной железы. Эндокринная. 2015; 50: 807–810. pmid: 25795291
60. 60. Мао Б.Х., Чен З.Й., Ван Ю.Дж., Янь С.Дж. Наночастицы серебра оказывают смертельное и сублетальное неблагоприятное воздействие на развитие и долголетие, вызывая стрессовые реакции, опосредованные АФК.Sci Rep.2018; 8: 2445. pmid: 29402973
61. 61. Duntas LH. Роль селена в развитии аутоиммунитета и рака щитовидной железы. Щитовидная железа. 2006. 16: 455–460. pmid: 16756467
62. 62. Вентура М., Мело М., Каррильо Ф. Селен и заболевание щитовидной железы: от патофизиологии к лечению. Int J Endocrinol. 2017; 2017: 1297658. pmid: 28255299
63. 63. Кларксон Т.В., Магос Л. Токсикология ртути и ее химических соединений. Crit Rev Toxicol. 2006; 36: 609–662. pmid: 16973445

границ | Получение и 97% очистка клеток щитовидной железы человека из дермальных фибробластов

Введение

Дефицит щитовидной железы, как необратимое патологическое изменение, возникает из-за врожденных аномалий, аутоиммунного тиреоидита, терапии радиоактивной абляцией и, конечно же, после операции на щитовидной железе.Эмбриональные стволовые (ES) клетки имеют большие перспективы для обеспечения неограниченного источника тироцитов, поскольку ES-клетки бесконечно самообновляются в культуре клеток (1) и могут быть дифференцированы в функциональные тироцитоподобные клетки (2, 3). Технология iPS позволяет генерировать плюрипотентные стволовые клетки из любой соматической клетки и предлагает потенциал аутологичной трансплантации клеток щитовидной железы, поскольку специфические для пациента клетки могут использоваться для клеточного репрограммирования (4). Таким образом, прогнозируется, что индивидуальные iPS-клетки пациента станут не только мощным инструментом для биологических исследований, но и мощным источником для процедур регенеративной медицины (5).

В текущем исследовании мы дифференцировали фолликулярные клетки щитовидной железы из свободных от интеграции и свободных от вирусов ИПСК, репрограммированных из фибробластов кожи человека, используя одну стадию трансфекции самореплицирующейся синтетической РНК для OCT4, KLF4, SOX2 и GLIS1 . Протокол, который мы ранее использовали для создания клеток щитовидной железы из эмбриональных стволовых клеток (2), затем был использован для подготовки функциональных фолликулярных клеток щитовидной железы. Используя обнаружение мРНК с помощью кПЦР и обнаружение белков с помощью иммунофлуоресценции, мы показываем, что такие терминально дифференцированные фолликулярные клетки могут собираться в фолликулы щитовидной железы и выделять гормон щитовидной железы, что открывает путь к заместительной терапии клеток щитовидной железы для отдельных пациентов с недостаточностью щитовидной железы.

Материалы и методы

Этическое заявление

Это исследование было одобрено комитетом по этике медицинских исследований Медицинской школы Икана на горе Синай. Информированное согласие было получено от добровольца, подвергнутого биопсии кожи.

Пролиферативная культура фибробластов кожи человека

Биопсия ядра кожи дермы была использована для создания культуры фибробластов кожи человека, как описано ранее (6). Свежевыделенный образец кожи, взятый у 59-летнего здорового мужчины, вскрыли и поместили в 0.Покрытые 1% желатином 6-луночные планшеты, содержащие 1 мл среды с высоким содержанием глюкозы DMEM (EMD Millipore) с 10% фетальной бычьей сывороткой (EMD Millipore, Берлингтон, Массачусетс) с 1% GlutaMAX (Life Technologies Corporation, Гранд-Айленд, штат Нью-Йорк) при 37 ° C с 5,0% CO ₂ . Среду меняли каждые 2–3 дня, и как только фибробласты становились конфлюэнтными на 70–90%, клетки пассировали с использованием 0,25% трипсина (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) и повторно высевали на 0,1% желатин (Sigma-Aldrich, St Луи, Миссури) пластины с покрытием (проход № 1).Кусочки ткани не прикрепились и были вымыты при смене среды.

Перепрограммирование фибробластов кожи человека в iPS-клетки

Перепрограммирование проводили с использованием набора для репрограммирования РНК Simplicon ™ (OKSG) (EMD Millipore, Берлингтон, Массачусетс) на клетках фибробластов кожи человека в пассаже № 2. За день до перепрограммирования 2 × 10 клеток ⁵ высевали в 6-луночный планшет (Corning, Corning, NY), покрытый 2% Matrigel (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) в культуральной среде, чтобы иметь на следующий день клетки достигают 60–80% конфлюэнтности.В день перепрограммирования фибробласты предварительно обрабатывали Advanced DMEM (Life Technologies Corporation, Гранд-Айленд, штат Нью-Йорк), содержащей 200 нг / мл человеческого рекомбинантного белка B18R (EMD Millipore, Берлингтон, Массачусетс), в течение 2 часов, чтобы помочь подавить клеточную активность. интерферонового ответа, затем клетки трансфицировали один раз всего 1 мкг смеси РНК (0,5 мкг VEE-OKS-iG / 0,5 мкг мРНК B18R), трансфицировали липофектамином 2000 в 1 мл opti-MEM (Life Technologies Corporation, Гранд-Айленд, Нью-Йорк. ). Через 3 часа среду для трансфекции заменили на среду стадии 1: Advanced DMEM, содержащую 200 нг / мл белка B18R, 2 мМ L-глутамина (Life Technologies Corporation, Гранд-Айленд, штат Нью-Йорк) и 10% FBS (GE Healthcare, Чикаго). , Иллинойс).Пуромицин (Invivogen, Сан-Диего, Калифорния) затем добавляли в среду стадии 1 после ежедневной смены среды до дня 9 после трансфекции. Через десять дней после трансфекции клетки отделяли с помощью Accumax ™ (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) и 1,0 × 10 ^{5 трансфицированных клеток} высевали в одну лунку 6-луночного планшета (Corning, Corning, NY) в Среда стадии 2, которая состояла из кондиционированной среды MEF (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота) с добавлением 10 нг / мл bFGF (R&D systems, Миннеаполис, Миннесота), ингибитора киназы TGF-β RI IV, бутирата натрия и PS48 (все из Simplicon) и 200 нг / мл белка B18R (EMD Millipore, Берлингтон, Массачусетс).Среду Этапа 2 меняли через день. Небольшие колонии появились на 14 день после трансфекции, а на 18 день белок B18R был удален из среды. Предполагаемые колонии iPS-клеток человека (hiPSc) отбирали вручную на 21 день и повторно высевали на планшеты, покрытые 2% Matrigel, в обычные среды для ES-клеток человека (mTeSR1 или StemFlex) и размножали в iPSc-средах при 37 ° C в атмосфере 5% CO2. . Эта линия клеток hiPS впоследствии называется LF-клетками.

Образование тератомы

Процедура оценки образования тератомы у голых мышей была одобрена Комитетом по уходу и использованию животных Медицинской школы Икана на горе Синай.Недифференцированные hiPSC (1 × 10 ⁶ клеток), суспендированные в 100 мкл матригеля (BD Biosciences, Франклин Лейкс, штат Нью-Джерси), вводили подкожно иммунодефицитным голым мышам в возрасте 6-8 недель (Jackson Laboratories, Фармингтон, Коннектикут, США). Через четыре недели после инъекции образовавшиеся тератомы фиксировали 10% формалином и обрабатывали для окрашивания гематоксилином и эозином и гистологической оценки.

Дифференциация iPS-клеток человека

Для дифференцировки клеток щитовидной железы 1 × 10 ⁶ HiPSC помещали в 6-луночный планшет и культивировали в течение 2 дней.Для инициации дифференцировки энтодермы HiPSCs один раз промывали PBS и культивировали в среде RMPI 1640 (Life Technologies Corporation, Гранд-Айленд, Нью-Йорк), содержащей 1% B27 (Life Technologies Corporation, Гранд-Айленд, Нью-Йорк) с добавлением 100 нг / мл активина A ( R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота) в течение 4 дней. Впоследствии добавки были заменены на этакридин (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) (концентрация, указанная в каждом эксперименте) для повышения транскрипционной активности PAX8 и NKX2-1 в течение 2 дней.За этим последовало дальнейшее воздействие на эти клетки бычьего ТТГ (1 мЕд / мл) для индукции дифференцировки щитовидной железы в течение всего 21 дня (рис. 1). Затем клетки помещали в матригель с ограничением по фактору роста (BD Biosciences, Франклин Лейкс, штат Нью-Джерси) и помещали в 6-луночные планшеты в RPMI 1640, содержащем 1% B27 (LifeTechnologies Corporation, Гранд-Айленд, штат Нью-Йорк) с добавлением 1 мЕ / мл. ТТГ для образования фолликулов щитовидной железы.

Рисунок 1 . Схема последовательного лечения для дифференциации клеток щитовидной железы от ИПСК человека (LF-клетки).

Анализ экспрессии гена

Для анализа экспрессии генов суммарную РНК экстрагировали с использованием набора RNeasy (Qiagen Ltd, Манчестер, Великобритания) и обрабатывали дезоксирибонуклеазой, не содержащей рибонуклеаз (Qiagen Ltd, Манчестер, Великобритания). Пять микрограммов общей РНК были обратно транскрибированы в кДНК с использованием системы SuperScript III (Invitrogen, San Diego, CA). Количественную ОТ-ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) проводили с использованием мастер-микса SYBR green qPCR (Applied Biosystems, Foster City, CA), используя систему StepOnePlus (Applied Biosystems, Foster City, CA).Относительные уровни экспрессии каждого гена в реальном времени анализировали с использованием метода 2 ^−−ΔΔCT и нормализовали по экспрессии гена домашнего хозяйства GAPDH. Представленные данные взяты из трех независимых экспериментов, в которых все наборы образцов были проанализированы в трех экземплярах.

Иммунофлуоресцентное окрашивание

Клетки выращивали в чашках для культивирования Delta T и фиксировали 4% параформальдегидом в фосфатно-солевом буфере (PBS) и трижды промывали PBS. После пермеабилизации в метаноле при -20 ° C в течение 10 минут, клетки блокировали в течение 60 минут 5% нормальной козьей сывороткой в ​​PBS, а затем инкубировали с соответствующими первичными антителами (подробности см. В таблице 1) в 0.1% Tween 20 и 1% BSA в PBS в течение ночи при 4 ° C. Клетки трижды промывали PBS и инкубировали с подходящим вторичным антителом, а затем дважды промывали PBS и устанавливали с использованием жестко закрепленной среды для монтажа, содержащей DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Флуоресцентные микрофотографии получали с помощью конфокального микроскопа LSM 700 с объективом 63X, изображения обрабатывали и собирали в Photoshop CS (Adobe, Сан-Хосе, Калифорния, США).

Таблица 1 . Антитела, используемые в описанных методах.

Измерение тироксина (T4)

Через 21 день дифференцированные ИПСК человека культивировали в модифицированной среде Хэма F12 (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс) с добавлением 5% бычьей телячьей сыворотки (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) и семи гормонов, включая бычий ТТГ ( 1 Ед / л), инсулин (10 мг / л), гидрокортизон (0,4 мг / л), трансферрин человека (5 мг / л), глицил-1-гистидил-1-лизинацетат (10 мкг / л), соматостатин ( 10 мкг / л) и NaI (10 мкг / л). Через 48 ч отработанный супернатант культуры собирали для измерения T ₄ с использованием метода магнитных шариков для щитовидной железы Millipore MAP (№ по каталогу RTHYMAG-30 K) в соответствии с протоколом производителя.Недифференцированные LF-клетки, выращенные в тех же условиях, использовали в качестве отрицательного контроля. Клетки щитовидной железы крысы Фишера (FRTL-5) секретировали Т4 при выращивании в среде с шестью гормонами (7) и были использованы в качестве положительного контроля. Все химические реагенты были приобретены у Sigma-Aldrich, если не указано иное. Все клетки культивировали в чашках, покрытых матригелем.

Очистка двойных положительных клеток

Поскольку NIS и TSHR являются двумя специфическими поверхностными маркерами щитовидной железы, которые экспрессируются во время дифференцировки, мы использовали эти маркеры для очистки клеток с помощью проточной цитометрии.Вкратце, конфлюэнтные слои дифференцированных клеток собирали с 1 мМ EDTA / EGTA в PBS (без кальция и магния). После однократной промывки 1XPBS 1 × 10 клеток ⁷ инкубировали в течение 30 мин при 4 ° C с моноклональными антителами к TSHR (RSR4), направленными на эпитоп TSHR aa 322-341- в концентрации 1 мкг / 10 клеток ⁶ и кроличьи поликлональные антитела против NIS человека в концентрации 0,2 мкг / 10 ⁶ клеток (таблица 1) с периодическим встряхиванием. Новое поликлональное антитело NIS к 15-мерному внешнему эпитопу (MEAVETGERPTFGAC) во внеклеточной части NIS использовали после характеристики с клетками FRTL-5 (см. Дополнительный рисунок 1).После двух промывок стерильным PBS клетки метили антимышиным IgG, конъюгированным с Alexa Fluor 647, и антикроличьим IgG, конъюгированным с Alexa Fluor 488, разведенным до 1: 1000 в среде RPMI, содержащей 1 мМ EDTA / 1 мМ EGTA плюс 1%. BSA в течение 20 мин при 4 ° C, затем дважды промывали и ресуспендировали в полной среде. Клетки, окрашенные по аналогичному протоколу с антимышиным IgG, конъюгированным с Alexa Fluor 647, и кроличьими IgG, конъюгированными с Alexa Fluor 488, использовали в качестве контролей для рисования ворот для положительных и отрицательных окрашенных клеток.Суспензию окрашенных клеток затем сортировали с использованием сортировщика BD FACSAria ™ III и анализировали с использованием программного обеспечения BD DIVA. Степень очистки отсортированных клеток определяли путем проверки FACS до и после очистки. Недифференцированные клетки использовали в качестве отрицательного контроля, чтобы показать специфичность окрашивания.

Результаты

Получение и характеристика индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК)

Фибробласты кожи человека изначально имели веретенообразную форму.После трансфекции и перепрограммирования клетки показали эпителиоидные изменения, и зрелые ИПСК (названные LF-клетками) имели правильную круглую форму в компактной колонии, напоминающую человеческие ES-клетки, и образовывали типичные отдельные эмбриоидные тельца (не показаны). Мы подтвердили плюрипотентность полученных ИПСК человека по их экспрессии клеточных маркеров, включая OCT4, TRA-1-60, NANOG и SSEA4, а также с помощью анализа FACS (рис. 2). In vivo тератомы образовывались у мышей nude, которым инъецировали hiPSC (клетки LF).Три зародышевых листка сформировали структуры в тератомах, что подтверждено гистологическим анализом, что указывает на плюрипотентность этих клеток (данные не показаны).

Рисунок 2 . Характеристика ИПСК человека (клетки LF). Экспрессия плюрипотентных маркеров OCT4, SOX2, TRA1-81 и NANOG в iPS-клетках человека, обнаруженная с помощью иммунофлуоресценции и FACS (дата указана в процентах в скобках). На вставках показаны контрольные фибробласты. Масштаб = 100 мкм.

Индукция эндодермы из ИПСК человека

Клетки дефинитивной энтодермы были сначала индуцированы воздействием на человеческие ИПСК активином А в течение 4 дней, о чем свидетельствует их экспрессия маркеров энтодермы SOX17 и FOXA2, которые были значительно индуцированы и высоко экспрессировались в обработанных активином А клетках по сравнению с контрольными ИПСК при оценке на экспрессия белка с помощью проточной цитометрии с иммуноокрашиванием (рис. 3A) и иммуноокрашиванием с помощью проточного цитометрического анализа (рис. 3B).Эти клетки энтодермы, полученные из активина А, также экспрессировали высокие уровни факторов транскрипции NKX2-1 и PAX8 по сравнению с человеческими ES-клетками, как это было обнаружено с помощью кПЦР (Рисунок 4A), иммуноокрашивания (Рисунок 4B) и анализа FACS (Рисунок 4C), как сообщалось ранее. (2). Результаты показали, что энтодермальные клетки человека были успешно индуцированы активином А.

.

Рисунок 3 . Индукция энтодермы в ИПСК человека (LF-клетки). (A) Типичная проточная цитометрия SOX17 и FOXA2 экспрессирующих клеток в обработанных активином А (нижние) и необработанные (верхние) клетки.Данные были репрезентативными для трех отдельных экспериментов на LF-клетках, обработанных активином А в течение 4 дней. (B) Типичные изображения иммуноокрашивания маркеров энтодермы, SOX17 (зеленый) и FOXA2 (красный), в LF-клетках, обработанных активином А, в течение 4 дней (верхняя панель) и необработанных клетках (нижняя панель). Масштабная линейка = 20 мкм.

Рисунок 4 . Дифференциация дефинитивной энтодермы щитовидной железы от ИПСК человека (LF-клетки). (A) Анализ количественной ПЦР факторов транскрипции щитовидной железы NKX2-1 и PAX8 в человеческих ES-клетках и человеческих iPSC (LF-клетках).Изменение кратности представлено как среднее значение ± стандартная ошибка среднего из трех независимых экспериментов. (B) Иммуноокрашивание NKX2-1 (красный) и PAX8 (зеленый) в клетках эндодермы щитовидной железы человека, полученных из ИПСК (LF-клетки). Масштабная линейка = 20 мкм. (C) Типичная проточная цитометрия клеток, экспрессирующих NKX2-1 и PAX8, в необработанных (вверху), обработанных активином A (в центре) и активирующих A + Ethacridine (внизу) клетках. Данные были репрезентативными для трех отдельных экспериментов.

Этакридин как усилитель специфических факторов транскрипции в энтодермальных клетках, производных ИПСК человека

Ранее мы использовали этакридин с небольшой молекулой для улучшения видообразования человеческих ES-клеток (2).Сначала мы оценили токсичность этакридина для ИПСК человека с помощью анализа жизнеспособности / пролиферации клеток после воздействия возрастающих доз этакридина в течение 48 часов. Не было цитотоксичности ИПСК человека до 8 мкМ, тогда как 10 мкМ показали значительную гибель клеток (данные не показаны) . Следовательно, 5 мкМ этакридина была оптимальной дозой, которую мы использовали для дифференцировки клеток щитовидной железы в последующих исследованиях. Как и ожидалось, этакридин значительно усиливал экспрессию мРНК TAZ по сравнению с необработанными и обработанными активином A ИПСК человека ( p <0.01) (Рисунок 5A). Мы также наблюдали полную ядерную транслокацию белка TAZ в клетках энтодермы человека, происходящих из hiPSC, обработанных активином А и этакридином, как определено с помощью количественной интенсивности флуоресценции (фиг. 5B) по сравнению с необработанными и только активином А. Этакридин дополнительно усиливал NKX2-1 и PAX8 в ИПСК человека, происходящих от активина А (фиг. 4A, C), как ранее наблюдалось в человеческих ES-клетках (2).

Рисунок 5 . Влияние этакридина на ТАЗ в ИПСК человека (LF-клетки). (A) Усиление TAZ в обработанной этакридином энтодерме активина А, полученной из ИПСК человека (LF-клетки). Данные были выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего и представляют собой один из трех отдельных экспериментов. ** p <0,01 обработанной этакридином энтодермы, полученной из активина A, по сравнению с необработанным или обработанным активином A отдельно. Данные были проанализированы с помощью дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом Стьюдента-Ньюмана-Кеулса. (B) Относительное содержание TAZ в клетках в цитоплазме и ядре определяли количественно из наборов из 10 клеток на изображение и выражали в произвольных единицах интенсивности флуоресценции (FI).Данные представляют собой средние значения ± SEM трех независимых экспериментов. ** P <0,01 сравнение между разными группами. Данные были проанализированы с помощью дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом Стьюдента-Ньюмана-Кеулса.

Дифференциация клеток щитовидной железы от ИПСК человека

После дальнейшей дифференцировки энтодермальных клеток, обработанных этакридином, с помощью TSH, тироидспецифические гены, NIS, TSHR, Tg и TPO, каждый продемонстрировал заметную экспрессию по сравнению с недифференцированными iPSCs (Фигуры 6A – F).Иммуноокрашивание TG (красный) и PAX8 (зеленый) (Рисунок 6C) и NIS (зеленый) (Рисунок 6E) было обнаружено в дифференцированных клетках, а не в недифференцированных клетках (Рисунки 6B, D). Эти дифференцированные клетки образовали трехмерные фолликулы щитовидной железы, экспрессирующие TSHR (фиг. 6F), что указывает на их преданность судьбе тироцитов и секретируемый тироидный гормон (T ₄ ) в их культуральную среду при добавлении йодида (фиг. 6G).

Рисунок 6 . Характеристика дифференцированных клеток щитовидной железы. (A) Анализ КПЦР генов, специфичных для щитовидной железы: TG, TPO, TSHR и NIS. Изменение складки представлено как среднее значение ± стандартная ошибка среднего из трех независимых экспериментов на дифференцированных клетках LF через 21 день. (B – F) Иммуноокрашивание генов щитовидной железы в недифференцированных и дифференцированных клетках LF на 21 день культивирования: (B, D) Недифференцированные клетки в качестве контроля. (C) Окрашивание TG (красный) и PAX8 (зеленый) в дифференцированных клетках. TG экспрессируется в цитоплазме, а PAX8 экспрессируется в ядре. (E) Окрашивание TG (красный) и NIS (зеленый) в дифференцированном фолликуле щитовидной железы: NIS экспрессировался в мембране, а TG экспрессировался в цитоплазме и просвете фолликула. (F) Неофолликулы щитовидной железы, полученные из дифференцированных клеток, экспрессирующих TSHR (зеленый) в мембране. На вставке показано окрашивание клеток щитовидной железы крысы FRTL-5. Масштабная линейка = 20 мкм. (G) Измерение Т4 из дифференцированных клеток LF: Т4 был обнаружен в среде с добавлением йода дифференцированных клеток LF на 23-дневное культивирование, как описано в методах, и отсутствовал в среде недифференцированных клеток, но в меньшей степени, чем в FRTL. -5 клеток со средой 7H.

Очистка клеток щитовидной железы человека

Используя двойное окрашивание TSHR-Ab и NIS-Ab, удалось добиться значительной очистки и количественного определения полученных клеток щитовидной железы человека (рис. 7). Двойные положительные клетки TSHR и NIS были значительно увеличены с фона 0,1% в недифференцированных LF-клетках до 58% в культурах дифференцированных клеток и до 97% клеток при очистке FACS.

Рисунок 7 . FACS-анализ экспрессии TSHR и NIS в дифференцированных клетках щитовидной железы.Недифференцированные клетки LF (вверху), дифференцированные клетки LF через 21 день (в центре) (58,35% двойных положительных) и очищенные дифференцированные клетки LF (внизу) (97,20% положительные), проанализированные на двойное окрашивание анти-NIS и ант-TSHR после сортировочной очистки .

Обсуждение

Фолликулярные клетки щитовидной железы долговечны и имеют медленное время обновления ~ 10 лет (8). Однако, как и другие ткани, щитовидная железа также подвержена аутоиммунному разрушению и раковым мутациям, вызывающим потерю клеток или требующим удаления железы.Заместительная терапия тироидными клетками — один из подходов к исправлению такого дефицита. IPSC, полученные от пациентов, — идеальный способ сделать возможным замещение индивидуальных клеток. В этом отчете мы демонстрируем успешное получение ИПСК человека из дермальных фибробластов и перепрограммирование этих клеток в функциональные фолликулярные клетки щитовидной железы человека. Наши результаты позволяют по-новому взглянуть на возможности индивидуальной заместительной терапии клетками щитовидной железы для лечения отдельных пациентов с недостаточностью щитовидной железы.Несмотря на то, что существует множество проблем безопасности, требующих тщательного рассмотрения, эти исследования являются «доказательством концепции» этого подхода. Проблемы, которые необходимо решить, включают отсутствие гомогенности клеток в клеточной популяции, иммуногенный потенциал полученных клеток и их неопластический потенциал, каждая из которых требует дальнейшего изучения на моделях in vivo .

В этом отчете мы описываем наши ранние исследования фибробластов кожи человека, которые были впервые изменены с помощью новой системы перепрограммирования, которая была эффективным методом для создания свободных от интеграции, свободных от вирусов ИПСК человека за один этап трансфекции.Технология основана на положительном виде одноцепочечной РНК, полученной из неинфекционного (неупаковочного) самовоспроизводящегося вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE) (9). Репликон РНК продуцирует синтетическую РНК, содержащую факторы репрограммирования OCT4, KLF4, SOX2 и GLIS1 (OKS-iG) в качестве полицистронного транскрипта, способного к саморепрограммированию в течение ограниченного числа клеточных делений. После создания ИПСК РНК избирательно удаляли путем удаления ингибитора гамма-интерферона (IFNg), B18R, из среды для культивирования клеток.В результате были получены ИПСК без трансгенов и репликонов. Gli-подобный фактор транскрипции Glis1 (цинковый палец 1 семейства Glis) заметно усиливает генерацию ИПСК как в мышиных, так и в человеческих фибробластах, когда он экспрессируется вместе с OKS. Анализ ДНК с помощью микроматрицы показывает, что Glis1 способствует множественным путям перепрограммирования, включая Myc, Nanog, Lin28, Wnt, Essrb и мезенхимно-эпителиальный переход (10). Следовательно, Glis1 эффективно способствует прямому репрограммированию соматических клеток во время генерации ИПСК.Используя эту коммерческую технологию, мы перепрограммировали фибробласты кожи человека и обнаружили, что колонии ИПСК впервые появились между 14–18 днями, а затем мы собрали их на 21 день. ИПСК характеризовались иммуноокрашиванием на маркеры стволовых клеток, и морфологически они обладали способностью образовывать три. размерные эмбриоидные тельца, наблюдаемые на культурах человеческих ES-клеток. Вероятно, это будет гораздо более безопасный подход к перепрограммированию клеток, чем использование экзогенной трансфекции генов (11).

Последующее получение дифференцированных клеток щитовидной железы из этих hiPSC с использованием активина А, этакридина и ТТГ дало результаты, аналогичные тем, о которых мы ранее сообщали при работе с человеческими ES-клетками (2).Однако следует отметить, что вполне вероятно, что легкость такой дифференциации может варьироваться между разными линиями клеток hiPS. Более того, хотя действие активина А полностью изучено (12, 13), механизм действия этакридина неясен. Хотя это, по-видимому, происходит в первую очередь за счет индукции фактора транскрипции TAZ, который является сигнально-зависимым ко-регулятором транскрипции, который способствует индукции NKX2-1 и PAX8 (14) — двух наиболее важных факторов для видообразования клеток щитовидной железы в клетках млекопитающих. и которые одновременно экспрессируются только в клетках-предшественниках щитовидной железы (14), другие данные свидетельствуют о том, что клетки щитовидной железы могут дифференцироваться до определенной степени без экспрессии TAZ (15).Однако сообщалось, что этакридин усиливает взаимодействие между TAZ и протеинфосфатазами (PP1A и PP2A) через ASPP2 или α-катенин, способствуя дефосфорилированию TAZ для увеличения нефосфорилированного TAZ в ядре (16). Внутри ядра TAZ взаимодействует с NKX2-1 и PAX8, увеличивает активность их промоторов и синергетически усиливает транскрипционные эффекты NKX2-1 и PAX8 на гены, специфичные для щитовидной железы. Это было показано с использованием ингибирующего мутантного ТАЗ, блокирующего его влияние на активность факторов транскрипции (14, 17).Истощение ТАЗ также значительно снижает количество клеток фолликулов щитовидной железы у рыбок данио, что снова указывает на то, что ТАЗ необходим для нормальной дифференцировки щитовидной железы (15). Вместе эти наблюдения показывают, что этакридин обладает способностью усиливать транслокацию TAZ в ядро ​​и усиливать ключевые факторы транскрипции щитовидной железы NKX2-1 и PAX8 в энтодермальных клетках, происходящих от ИПСК человека.

Чтобы понять эпигенетический контроль видообразования клеток щитовидной железы, мы ранее профилировали доступность хроматина с помощью метода ATAC-seq и исследовали метилирование ДНК и ацетилирование гистонов промоторных областей факторов транскрипции, связанных с щитовидной железой, и генов, специфичных для щитовидной железы, во время дифференцировки клеток hES (18). .Анализ ATAC-seq показал улучшенную доступность хроматина в промоторных областях TAZ, NKX2-1 и PAX8 после воздействия активина А плюс этакридина в отличие от одного активина А [Ma et al. (18) Thyroid, 2020, в печати]. Несмотря на отсутствие изменений в метилировании промоторов NKX2-1, PAX8 и TAZ с помощью бисульфитного секвенирования, мы показали, что ацетилирование гистона h5 (Ach5), особенно лизина 16 (h5K16ac), наблюдалось в промоторах при измерении методом иммунопреципитации (ChIP). ПЦР-анализы, которые коррелировали с активностью и экспрессией генов NKX2-1, PAX8, NIS, TSHR и TG.Эти результаты предполагают, что эпигенетические изменения, вызванные этакрдином, передаются последующим поколениям клеток для сохранения программы дифференциации.

Функциональность полученных клеток щитовидной железы имеет первостепенное значение. Ранее мы показали, что такие клетки, полученные из культур ES-клеток человека, способны не только образовывать фолликулы, но также поглощать радиоактивный йод и секретировать йод, связанный с белками (PBI), что свидетельствует о неизменной программе органификации (2).Кроме того, мы скорректировали нашу гипотиреозную мышь TSHR-KO путем трансплантации дифференцированных мышиных ES-клеток и повышения их уровня Т4 в сыворотке и подавления их ТТГ (Latif et al., Unpublished), как ранее было показано другими с нормальными, но гипотиреозными мышами (3, 19 ). В текущем исследовании мы также продемонстрировали, что полученные клетки щитовидной железы человека способны секретировать Т4 при введении йодида, что подтверждает их функциональность in vitro .

Гетерогенность клеток щитовидной железы, полученных из стволовых клеток, вызывает серьезную озабоченность.Развитие опухолевых образований может быть довольно обычным для культур, полученных из ES, из-за такой клеточной гетерогенности, но, по-видимому, менее распространено для перепрограммированных iPSC клеток. Однако долгосрочные данные о выживании in vivo привитых клеток и ткани, которую они образуют, остаются скудными. Исследования с ES-клетками мыши и человека показали, что очистка может быть эффективно проведена путем включения репортерных генов, которые обеспечивают легкий отбор (3, 20, 21). Хотя было бы просто получить высокоочищенные клетки с трансфицированными маркерами, такими как меченые NKX2-1 (3), трансплантация таких измененных клеток вряд ли будет приемлемой для пациентов.Более того, даже если это будет принято, в долгосрочной перспективе почти наверняка возникнет иммунная реакция на трансген. Напротив, здесь мы стремились достичь очистки с помощью нативной экспрессии двух поверхностных маркеров щитовидной железы — NIS и TSHR. С помощью этого подхода в текущих экспериментах мы достигли более 90% очистки дифференцированных клеток щитовидной железы от клеток LF с использованием подхода двойных антител с FACS. Этот подход с использованием очищенных клеток сделает терапию аутологичными клетками щитовидной железы более реалистичной.

Таким образом, мы описываем успешное получение ИПСК человека с использованием свободного от интеграции, безвирусного метода и демонстрируем дифференцировку и очистку этих клеток в функциональные фолликулярные клетки щитовидной железы. Как и раньше, мы использовали этакридин для усиления экспрессии PAX8 и NKX2-1 в клетках энтодермы, происходящих от активина A, а затем окончательно дифференцировали их в присутствии TSH. Эти дифференцированные ИПСК образуют трехмерные фолликулы щитовидной железы и экспрессируют специфические для щитовидной железы гены и белки и секретируют Т4.Эти результаты указывают на потенциал простого подхода для создания специфичных для пациента эпителиальных клеток щитовидной железы.

Заявление о доступности данных

Необработанные данные, подтверждающие выводы этой статьи, будут предоставлены авторами без излишних оговорок.

Заявление об этике

Исследования с участием людей были рассмотрены и одобрены Медицинской школой Икана на горе Синай. Пациенты / участники предоставили письменное информированное согласие на участие в этом исследовании.

Взносы авторов

RM задумал работу, разработал и провел эксперименты, а также написал рукопись. РС проводил эксперименты. SM разработала и провела рецензирование статьи. Р.Л. задумал работу, провел эксперименты и написал рукопись. TD задумал работу, провел эксперименты и написал рукопись. Все авторы просмотрели, отредактировали и одобрили рукопись.

Финансирование

Эта работа была частично поддержана DK069713 Национальным институтом здравоохранения, Фондом семьи Сигал и программой VA Merit Award (TD).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fendo.2020.00446/full#supplementary-material

Список литературы

1. Murry CE, Keller G. Дифференциация эмбриональных стволовых клеток в клинически значимые популяции: уроки эмбрионального развития. Cell. (2008) 132: 661–80. DOI: 10.1016 / j.cell.2008.02.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

2. Ма Р., Моршед С.А., Латиф Р., Дэвис Т.Ф. Индукция ТАЗ направляет дифференцировку фолликулярных клеток щитовидной железы от эмбриональных стволовых клеток человека. Щитовидная железа. (2017) 27: 292–9. DOI: 10.1089 / th.2016.0264

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

3. Курманн А.А., Серра М., Хокинс Ф., Ранкин С.А., Мори М., Астапова И. и др.Восстановление функции щитовидной железы путем трансплантации дифференцированных плюрипотентных стволовых клеток. Cell Stem Cell. (2015) 17: 527–42. DOI: 10.1016 / j.stem.2015.09.004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

4. Такахаши К., Яманака С. Индукция плюрипотентных стволовых клеток из культур эмбриональных и взрослых фибробластов мыши с помощью определенных факторов. Cell. (2006) 126: 663–76. DOI: 10.1016 / j.cell.2006.07.024

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

6.Вангипурам М., Тинг Д., Ким С., Диаз Р., Шуле Б. Культура эксплантата для биопсии кожи для получения первичных фибробластов человека. J Vis Exp . (2013) 77: e3779. DOI: 10.3791 / 3779

CrossRef Полный текст | Google Scholar

7. Ли BC, Кан С.И., Ан YM, Doo HK, Ahn SY. Альтернативная терапия болезни Грейвса: клинические эффекты и механизмы растительного лекарственного средства. Biol Pharm Bull. (2008) 31: 583–7. DOI: 10.1248 / bpb.31.583

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

8.Coclet J, Foureau F, Ketelbant P, Galand P, Dumont JE. Кинетика клеточной популяции в щитовидной железе взрослых собак и человека. Clin Endocrinol. (1989) 31: 655–65. DOI: 10.1111 / j.1365-2265.1989.tb01290.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

9. Йошиока Н., Грос Э., Ли Х. Р., Кумар С., Дикон, округ Колумбия, Марон С. и др. Эффективное создание ИПСК человека с помощью синтетической самовоспроизводящейся РНК. Cell Stem Cell. (2013) 13: 246–54. DOI: 10.1016 / j.stem.2013.06.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

10. Сковилл Д.В., Канг Х.С., Джеттен А.М. GLIS1-3: новые роли в репрограммировании, дифференцировке и поддержании стволовых клеток и клеток-предшественников. Исследование стволовых клеток. (2017) 4:80. DOI: 10.21037 / sci.2017.09.01

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

11. ван ден Берг К. В., Ритсма Л., Аврамут М. С., Виерсма Л. Е., ван ден Берг Б. М., Леунинг Д. Г. и др. Субкапсулярная трансплантация почечных органоидов, происходящих из PSC, индуцирует неоваскулогенез и значительное созревание клубочков и канальцев in vivo . Отчеты о стволовых клетках. (2018) 10: 751–65. DOI: 10.1016 / j.stemcr.2018.01.041

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

12. Кубо А., Шинозаки К., Шеннон Дж. М., Кускофф В., Кеннеди М., Ву С. и др. Развитие дефинитивной энтодермы из эмбриональных стволовых клеток в культуре. Развитие. (2004) 131: 1651–62. DOI: 10.1242 / dev.01044

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

13. Д’Амур К.А., Агульник А.Д., Элиазер С., Келли О.Г., Кроон Э., Баетге Э.Эффективная дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека в дефинитивную энтодерму. Nat Biotechnol. (2005) 23: 1534–41. DOI: 10.1038 / nbt1163

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

14. Ди Пальма Т., Д’Андреа Б., Лигуори Г.Л., Лигуоро А., де Кристофаро Т., Дель Прете Д. и др. TAZ является коактиватором для Pax8 и TTF-1, двух факторов транскрипции, участвующих в дифференцировке щитовидной железы. Exp Cell Res. (2009) 315: 162–75. DOI: 10.1016 / j.yexcr.2008.10.016

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

15. Паппалардо А., Поррека И., Капути Л., Де Феличе Э., Шульте-Меркер С., Заннини М. и др. Развитие щитовидной железы у рыбок данио без Taz. Mech Dev. (2015) 3 (Pt 138): 268–78. DOI: 10.1016 / j.mod.2015.10.002

CrossRef Полный текст | Google Scholar

16. Кавано С., Маруяма Дж., Нагашима С., Инами К., Цю В., Иваса Х и др. Клеточный скрининг активаторов ТАЗ определяет этакридин, широко используемый антисептик и абортивное средство, как соединение, которое способствует дефосфорилированию ТАЗ и ингибирует адипогенез в клетках C3h20T1 / 2. J. Biochem. (2015) 158: 413–23. DOI: 10.1093 / jb / mvv051

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

17. Park KS, Whitsett JA, Di Palma T, Hong JH, Yaffe MB, Zannini M. TAZ взаимодействует с TTF-1 и регулирует экспрессию сурфактантного протеина-C. J. Biol Chem. (2004) 279: 17384–90. DOI: 10.1074 / jbc.M312569200

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

19. Антоника Ф., Каспршик Д.Ф., Опиц Р., Яковино М., Ляо XH, Думитреску AM и др.Создание функциональной щитовидной железы из эмбриональных стволовых клеток. Природа. (2012) 491: 66–71. DOI: 10.1038 / природа11525

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

20. Серра М., Алисандратос К.Д., Хокинс Ф., Макколи К.Б., Джейкоб А., Чой Дж и др. Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток выявляет различные пути развития, регулирующие спецификацию легочных и тироидных клонов. Развитие. (2017) 144: 3879–93. DOI: 10.1242 / dev.150193

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

21.Longmire TA, Ikonomou L, Hawkins F, Christodoulou C, Cao Y, Jean JC и др. Эффективное получение очищенных предшественников легких и щитовидной железы из эмбриональных стволовых клеток. Cell Stem Cell. (2012) 10: 398–411. DOI: 10.1016 / j.stem.2012.01.019

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Молекулярный вид нормальной структуры и функции щитовидной железы человека, реконструированный по эталонной карте транскриптома | BMC Genomics

Нормальная карта транскриптома щитовидной железы человека

Щитовидная железа человека — чрезвычайно дифференцированный орган, выполняющий исключительные функции, связанные, в частности, с выработкой гормонов, с различными действиями, необходимыми для нормального развития, роста и функционирования организма.Эта особенность хорошо отражена в классических диссертациях о щитовидной железе в областях биохимии [19], гистологии [20], анатомии [3] и физиологии [21], где типичные белки, происходящие из щитовидной железы, считаются маркером органа. Современные технологии как в молекулярной, так и в вычислительной биологии теперь делают возможным количественное, глобальное представление всего профиля транскрипции гена в клеточном типе, который не зависит от предыдущих знаний, но позволяет систематически реконструировать критические аспекты экспрессии генов на геномном уровне.

Мы представляем здесь количественную эталонную карту транскриптома всей нормальной щитовидной железы человека, то есть эталонное типичное значение экспрессии для каждого из 27 275 известных, нанесенных на карту и 13 002 не охарактеризованных (неотмеченных) транскриптов. Доступные данные по экспрессии генов из соответствующего числа образцов и различных источников были интегрированы с помощью программного обеспечения TRAM [17], в результате чего был получен атлас экспрессии генов всей железы, полезный в качестве «общеприменимой» модели транскриптома нормальной щитовидной железы.На самом деле, подход TRAM совсем недавно был успешно использован для сравнения нормальных и патологических состояний при раке толстой кишки [22] и болезни Паркинсона [23], поэтому возможные возможные применения атласа, который мы здесь предоставили, включают количественные, систематические сравнения этого профиля. с образцом, полученным из образцов нормальных и близких к опухоли щитовидной железы, а также образцов опухолей в дальнейших исследованиях по этим предметам.

Программный анализ TRAM обеспечивает сегментное представление генома, которое может помочь идентифицировать домены хроматина, гены которых кодируют белки, взаимодействующие друг с другом или принадлежащие одному и тому же клеточному пути [17].

Карты транскриптомов показали превосходный портрет физиологии щитовидной железы, фактически первый сверхэкспрессированный сегмент находится на chr8 (Таблица 1) и включает известные гены TG и NDRG1 . Первый ген кодирует форму хранения гормона щитовидной железы, основного продукта щитовидной железы, который накапливается в больших количествах в просвете фолликулов щитовидной железы. Экспрессия второго гена повышена в карциномах щитовидной железы по сравнению с нормальными и доброкачественными поражениями щитовидной железы и коррелирует с более поздними стадиями опухоли [24]. NDRG1 является членом семейства генов с подавлением N-myc (суперсемейство альфа / бета гидролаз) и кодирует цитоплазматический белок, участвующий в стрессовых ответах, гормональных ответах, росте и дифференцировке клеток, необходимых для опосредованной p53 активации каспазы и апоптоза (см. запись NCBI Gene https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/10397). Этот же сегмент также включает кластер EST Hs.654670, который, как было обнаружено, высоко экспрессируется в щитовидной железе, согласно его профилю UniGene EST, и чей транскрипт увеличен в ~ 141 раз в щитовидной железе по сравнению с тканями, не связанными с щитовидной железой, согласно нашей карте.Этот сегмент может представлять ранее неизвестный кластер генов, сходящихся в специализированных функциях щитовидной железы, и где физическая близость может указывать на ко-регуляцию экспрессии.

Второй сегмент сверхэкспрессии находится на chr16 (Таблица 1) и включает кластер генов металлотионеинов: MT2A , MT1E , MT1A , MT1F , MT1G , MT1H и MT1H и MT1H и . Металлотионеины представляют собой цитопротекторные белки, действующие как поглотители токсичных ионов металлов или активных форм кислорода.Они активируются при фолликулярной карциноме щитовидной железы и рассматриваются как маркер стресса щитовидной железы при болезни Грейвса [25]. Авторы предположили, что ТТГ является ключевым регулятором экспрессии металлотионеина в тироцитах. Фактически, стимуляция TSHR индуцировала экспрессию изоформы 1X металлотионеина ( MT1X ) в клетках фолликулярной карциномы человека [25]. Экспрессия MT1G (металлотионеин 1G) часто подавлялась или подавлялась в клеточных линиях рака щитовидной железы, а также значительно снижалась в тканях первичного рака щитовидной железы по сравнению с доброкачественными тканями щитовидной железы [26].Сегментное представление карты транскриптома может быть использовано для поиска тех доменов хроматина, включая гены, менее охарактеризованные по отношению к ткани щитовидной железы (см. Таблицу 1 и файл результатов TRAM, доступный по адресу: http://apollo11.isto.unibo.it/suppl) .

На уровне одного гена анализ наиболее сверхэкспрессированных генов показывает локусы, которые могут иметь типичную функцию щитовидной железы. К ним относятся хорошо известные гены и не охарактеризованные локусы, исследование которых следует продолжить (Таблица 2). Наиболее экспрессируемым известным геном снова является TG (значение экспрессии = 8,662.34) (Таблица 2), однако максимальное значение экспрессии представлено картированием кластера EST Hs.732685 (значение экспрессии = 10,763,93) в пределах известного локуса MALAT1 (транскрипт 1 аденокарциномы легких, ассоциированный с метастазами (не белковый — кодирование)) на chr11, как показывает анализ BLASTN. Мы обнаружили, что платформенный зонд (1558678_s_at от платформы GPL570) относится к MALAT1 , но, выполняя биоинформатический анализ, мы отметили, что этот кластер в основном характеризуется антисмысловыми последовательностями относительно ориентации MALAT1 .Эти данные могут объяснить различную экспрессию между EST-кластером Hs.732685 и MALAT1 (значения экспрессии 10,763,92 и 2180,86, соответственно). Из-за широко распространенной экспрессии на высоком уровне в тканях человека, возможно, что этот не охарактеризованный транскрипт является геном домашнего хозяйства. Этот кластер ранее был обнаружен как сверхэкспрессируемый на карте транскриптома гиппокампа [18].

Основная функция щитовидной железы заключается в производстве гормонов щитовидной железы в больших количествах, и это может быть отражено тем фактом, что среди 5 наиболее экспрессируемых генов включены RPL41 (значение экспрессии = 5903.29), кодирующий рибосомный белок L41, и EEF1A1 (значение экспрессии = 5537,45), кодирующий эукариотический фактор элонгации трансляции 1 альфа 1, который отвечает за ферментативную доставку аминоацил тРНК к рибосоме [27]. Их сверхэкспрессия может рассматриваться как признак активного синтеза белка. Анализ базы данных EST для EEF1A1 показал очень высокую экспрессию в различных тканях человека и, в соответствии с его основной функцией домашнего хозяйства, очень высокий уровень экспрессии в клетках, активно продуцирующих белки в процессе трансляции, неудивителен.

Другим известным с высокой степенью экспрессией геном является TPT1 (значение экспрессии = 5743,83), кодирующий опухолевый белок, трансляционно-контролируемый 1 (TCTP), который представляет собой высококонсервативный, цито-защитный белок, участвующий во многих физиологических и болезненных процессах, в конкретный рак, где он связан с неблагоприятным прогнозом [28].

В связи с тем, что ДС, при которой трисомия 21 хромосомы приводит к измененному состоянию экспрессии генов, характеризуется высокой распространенностью дисфункции щитовидной железы, в частности врожденного гипотиреоза [29], особое внимание было уделено экспрессии chr21 гены, которые уже были сверхэкспрессированы на картах транскриптомов, созданных TRAM при сравнении диплоидных и трисомных клеток крови [30].На нашей карте транскриптома щитовидной железы наиболее выраженным геном chr21 является TFF3 (значение экспрессии = 2726,93). Недавно TFF3 был описан как ген, который может функционировать как онкоген или онкосупрессор в зависимости от клеточного контекста. Фактически, во многих типах солидных опухолей наблюдалось повышение уровня экспрессии TFF3 , тогда как во всех раках щитовидной железы фолликулярно-клеточного происхождения его экспрессия была снижена, когда в нормальной щитовидной железе он был высоко экспрессирован [31].Другими известными сверхэкспрессируемыми генами на chr21 являются CSTB (цистатин B) и SOD1 (супероксиддисмутаза 1, растворимая) (таблица 2), кодирующие, соответственно, ингибитор протеазы, который, как сообщается, защищает нейроны от окислительного стресса, и для разрушитель свободных супероксидных радикалов, контролирующий окислительно-восстановительное состояние клеток. Недавние результаты подтверждают гипотезу о прямом взаимодействии между двумя белками, которое может иметь отношение к повышению чувствительности клеток к условиям окислительного стресса [32].Авторы предлагают общий путь активации их транскрипции. Коэффициент экспрессии, полученный из анализа TRAM, между двумя генами составляет 1,098, что соответствует стехиометрическому молекулярному соотношению 1: 1 между белками, которые работают связанными в молекулярном комплексе. Было бы интересно углубить функции сверхэкспрессированных генов chr21, изучить их в связи с патогенезом DS и поискать новые гены на chr21 (где известно всего 273 гена [33]) в свете того факта, что что очень маленькая область, очевидно межгенная, по-видимому, сохраняется у всех субъектов с диагнозом DS [34].Изучение патогенеза врожденного гипотиреоза, а также других изменений, связанных с DS, также будет использовать преимущества только что выпущенного транскриптомного атласа, полученного методом RNA-Seq в 15 нормальных тканях и органах человеческого эмбриона, среди которых есть щитовидная железа [35]. .

Дифференциальная карта транскриптомов: щитовидная железа по сравнению с пулом тканей, не связанных с щитовидной железой

Чтобы выделить профиль экспрессии генов, специфичных для щитовидной железы, был точно собран пул сравнения, состоящий из 624 образцов, полученных из 53 различных тканей или органов человека.Карта дифференциального транскриптома была получена путем сравнения всей щитовидной железы с пулом тканей, не относящихся к щитовидной железе. Последнее позволило нам получить среднее значение для каждого гена из тканей, не относящихся к щитовидной железе.

Карта дифференциальных транскриптомов показала сверхэкспрессию доменов хроматина, включая гены, которые, как известно, участвуют в функции щитовидной железы. Например, первый сегмент на chr8 снова включает известный ген TG , за которым следует сегмент на chr14, включающий NKX2-1 .Мы также обнаружили IYD в третьем сегменте на chr6 и PAX8 в четвертом сегменте на chr2 (Таблица 1). Все эти гены, кодирующие специфические для щитовидной железы транскрипционные факторы или ферменты, играют фундаментальную роль в синтезе гормонов щитовидной железы [36].

Подробный анализ результатов может быть расширен на все пере- и недоэкспрессированные сегменты (см. Файл результатов TRAM, доступный по адресу: http://apollo11.isto.unibo.it/suppl). Результаты доказали, что среди сверхэкспрессированных сегментов преобладают те, которые включают гены с типичной функцией щитовидной железы, в отличие от того, что можно наблюдать среди недоэкспрессированных сегментов, как ожидалось с помощью дифференциальной карты транскриптома щитовидной железы vs.все ткани, не относящиеся к щитовидной железе (таблица 1).

Анализ на уровне одного гена показывает молекулярный атлас функций щитовидной железы и гистологической структуры. Просто наблюдая за списком первых 100 генов (из 26 750 локусов; дополнительный файл 4), упорядоченных в соответствии с убывающими значениями дифференциальной экспрессии, мы обнаружили гены, участвующие во всех фазах синтеза гормонов щитовидной железы. И снова наиболее сверхэкспрессируемым геном является TG , кодирующий каркас для йодирования тирозина и формы хранения гормона щитовидной железы, за которым следует TPO , продукт которого выполняет йодирование остатков тирозина в TG и образование фенокси-эфира между парами йодированных тирозинов. для выработки гормонов щитовидной железы.За ними следовали известные кодирующие гены SLC26A7 , IYD , TSHR и SLC26A4 (член 4 семейства 26 растворенных носителей) (таблица 3 и дополнительный файл 4). IYD катализирует дейодирование моно- и дииодтирозина и необходим для спасения йодида [37] и дальнейшего производства гормонов. Наличие большого количества ТТГР на клетках щитовидной железы имеет решающее значение для их реакции на основной тироид-стимулирующий фактор ТТГ. SLC26A7 и SLC26A4 относятся к семейству анионообменников [38], и, в частности, известно, что SLC26A4 обменивает ионы йода.Также, демонстрируя высокие значения дифференциальной экспрессии (от 18,20 до 12,54-кратного увеличения по сравнению с тканями, не связанными с щитовидной железой), мы отметили гены NKX2-1 , PAX8 , FOXE1 и HHEX (гематопоэтический экспрессируемый гомеобокс), которые кодируют факторы транскрипции, необходимые для развития и роста щитовидной железы, как и для гормоногенеза у взрослых, посредством регуляции экспрессии генов, участвующих в этом процессе. Эти факторы транскрипции экспрессируются также в других тканях, но коэкспрессируются только в щитовидной железе [39].Другие гены с высокой дифференциальной экспрессией (коэффициент дифференциальной экспрессии> 7) с известными функциями щитовидной железы — это DIO1 и DIO2 , кодирующие дейодиназы, катализирующие превращение T ₄ в T ₃ , более активную форму гормона щитовидной железы, и DUOX2 , кодирующий фермент, включенный в систему генерации пероксида, которая является частью белкового комплекса, катализирующего синтез тироидного гормона вместе с ТПО [40, 41].

Мы также можем считать, что функциональное значение некоторых генов не всегда связано с уровнем их экспрессии.Это классическая аксиома, что щитовидная железа производит гормоны щитовидной железы и кальцитонин, но насколько экспрессируется ген кальцитонина? На нашей карте ген CALCA (кальцитонин-родственный полипептид альфа), кодирующий основную форму кальцитонина, продуцируемого щитовидной железой, показал абсолютное значение экспрессии в щитовидной железе 218,27 по сравнению со значением экспрессии TG , равным 8662,34 (соотношение = 39.69), когда значение щитовидной железы CALCA сравнивалось со средним значением, полученным из пула тканей, не относящихся к щитовидной железе, коэффициент дифференциальной экспрессии составлял 3.65-кратное увеличение ( TG показал коэффициент дифференциальной экспрессии = 188,22) с разницей между двумя генами в 51,57 раза (дополнительный файл 4). Также следует учитывать, что клетки, продуцирующие кальцитонин, количественно намного меньше фолликулярных клеток (см. Раздел «Предпосылки»), и что в любом случае значима дифференцированная экспрессия в 3,5 раза.

Среди генов chr21 коэффициент экспрессии выше 10 наблюдался для гена TFF3 (коэффициент экспрессии = 16.14), который снова является наиболее сверхэкспрессируемым геном chr21 (Таблица 3), вероятно, из-за его типичной функции в нормальной щитовидной железе. За ним следует не охарактеризованный кластер EST Hs.129583 (коэффициент экспрессии = 11,10) (таблица 3).

Здесь следует отметить, что при работе с самыми низкими значениями экспрессии гена на нашей карте они описывают очень низкую или нулевую активность гена, но они не позволяют делать выводы о биологической информации, связанной с конкретным геном. репрессия в рассматриваемой ткани, потому что использование пула различных тканей, не связанных с щитовидной железой, в нашей общей модели может скрыть, подавляется ли ген специфически в щитовидной железе или он очень сильно экспрессируется тканеспецифично в другом месте.Тем не менее, наличие данных как для одной только щитовидной железы (абсолютное значение), так и для пула щитовидной железы по сравнению с другими (значение отношения) может помочь в анализе отдельных представляющих интерес ситуаций.

Это количественное представление экспрессии генов в щитовидной железе человека, полученное без каких-либо априорных конкретных предположений и полностью согласующееся с установленными биологическими знаниями о структуре / функции щитовидной железы, кажется, показывает на молекулярном уровне классическое описание базовой гистологии ткани щитовидной железы. .Это также предполагает, что другие гены с менее охарактеризованной ролью в щитовидной железе, но с соответствующей специфической экспрессией в этом органе, могут иметь критические функции для молекулярной физиопатологии щитовидной железы. Например, SLC26A7 , в настоящее время известный своей ролью в почках (запись гена NCBI 115111), оказывается здесь известным геном, наиболее сверхэкспрессируемым в щитовидной железе по сравнению с тканями, не относящимися к щитовидной железе (67 раз), при одновременной необходимости На сегодняшний день не описаны функции или фенотип, связанные с щитовидной железой (Таблицы 3 и 5).Интересно, что синдром, характеризующийся глухотой и зобом щитовидной железы (синдром Пендреда), был связан с мутациями родственного гена SLC26A4 , также принадлежащего к тому же семейству генов-переносчиков анионов и сверхэкспрессированного в щитовидной железе (Таблица 5). Неохарактеризованные кластеры EST, высоко и специфически экспрессируемые в щитовидной железе (Таблица 3), могут быть связаны таким же образом с неизвестными в настоящее время функциональными локусами, играющими важную роль в этом органе.

Уровень экспрессии генов в щитовидной железе и ассоциация с мутантными фенотипами щитовидной железы

Интересное открытие очень высокого дифференциального уровня экспрессии в щитовидной железе по отношению к тканям, не относящимся к щитовидной железе, для ряда специфичных для щитовидной железы генов, кодирующих белки, имеющие фундаментальное значение для производства гормонов щитовидной железы , позволили нам проверить, существует ли корреляция между высоким уровнем дифференциальной экспрессии и возникновением патологического фенотипа при мутации этих генов.Даже учитывая только первые 50 наиболее экспрессируемых известных генов в щитовидной железе, статистически значимая ассоциация ( p = 0,023) между сущностью профиля дифференциальной экспрессии гена (значения отношения A / B) в тканях щитовидной железы и тканях, не относящихся к щитовидной железе. и описание патологических фенотипов щитовидной железы в OMIM, когда эти гены мутированы, может наблюдаться (Таблица 5).

Примечательно, что это демонстрация того, что эталонные количественные значения экспрессии для гена в ткани могут систематически использоваться в качестве ключей, чтобы связать мутацию в этом гене или аномальное количественное изменение в его экспрессии с повышенной вероятностью того, что изменение может влияют на функцию данной ткани человека.Описанная здесь карта может функционировать как карта прогнозирования, предоставляя возможность открывать новые гены, играющие ключевую роль в щитовидной железе, и, следовательно, поддерживать дальнейшие исследования гена заболевания щитовидной железы. Однако следует отметить, что также мутации генов, экспрессируемых на низком уровне, например, для некоторых факторов транскрипции или регулирующих РНК, могут иметь сильное влияние на фенотип.

Экспрессия генов с учетом пола в щитовидной железе человека

Мы провели исследование экспрессии генов с учетом пола во всей щитовидной железе, чтобы выяснить, оказывает ли пол значительное влияние на профиль экспрессии генов щитовидной железы, наблюдаемый в нашем анализе.С этой целью была получена дополнительная дифференциальная карта транскриптома для исследования специфических моделей экспрессии генов, обусловленных полом.

Интересно, что при сортировке по значениям экспрессии пула A.1 (мужская щитовидная железа) мы отметили, что более экспрессируемые гены имеют сходный паттерн экспрессии у обоих полов с дифференциальным соотношением, близким к 1 (дополнительный файл 6). Эти результаты являются дополнительным подтверждением надежности данных, полученных с помощью нашей карты, и подтверждают высокую дифференциальную экспрессию в основном небольшого процента генов, которые, как известно, имеют различную экспрессию между мужчинами и женщинами, большинство из которых связаны с полом, в то время как гены, важные для функции щитовидной железы, одинаково экспрессируются у представителей обоих полов (рис.2). Melé et al. [16] недавно продемонстрировали, что вариация в экспрессии генов больше среди тканей (47%), чем среди людей (4%).

Экспериментальная проверка карты транскриптома щитовидной железы

Чтобы доказать надежность карты транскриптома щитовидной железы, созданной с помощью программного обеспечения TRAM, мы провели экспериментальную проверку полученных данных. Отличная корреляция между ожидаемыми и наблюдаемыми данными ( r = 0,93, p -значение <0,0001) (рис.3) позволяет нам рассматривать все другие промежуточные значения среди выбранных нами точек как истинные значения, таким образом, впервые обеспечивая надежное и количественное представление значений эталонного выражения для 27 275 сопоставленных транскриптов и 13 002 не охарактеризованных (неотображенных) транскриптов всего нормальная щитовидная железа человека. Эти данные предполагают, что наша систематическая карта транскриптомов, выделяя интересные аспекты структуры и функции нормальной щитовидной железы человека, может быть полезным инструментом в качестве количественного ориентира для исследований экспрессии генов, связанных с этой железой в целом, в физиологически нормальном состоянии. состояние.

Количественные результаты, обычно обеспечиваемые подходом TRAM, выгодно отличаются от результатов, предоставляемых другими доступными инструментами, способными извлекать информацию об уровнях экспрессии генов из опубликованных наборов данных, поскольку расширенный процесс присвоения зонда локусу максимизирует количество транскриптов для что позволяет получить значение выражения, в то время как мощный алгоритм интеграции данных с различных экспериментальных платформ ослабляет систематические ошибки, связанные с отдельными платформами.Ранее мы показали, в случае карты транскриптома мозга, что карта TRAM предлагает определенные преимущества перед атласом экспрессии специфических генов мозга [12]. Чтобы просто, но наглядно сравнить данные, представленные здесь для щитовидной железы человека, с данными, предоставленными Атласом экспрессии генов EBI [42] (https://www.ebi.ac.uk/gxa/home), мы извлекли из этого браузера численные значения уровня экспрессии 16 генов, которые мы успешно измерили с помощью ОТ-ПЦР (дополнительный файл 8), выбрав « Homo sapiens » в качестве организма и «Щитовидную железу» в качестве ткани, а затем рассмотрев первые два предложенных набора данных: « GTEx »[43] и« Illumina Body Map »(основанные на RNA-Seq и нормализованные с помощью метода RPKM (чтения на миллион килобаз)).Коэффициент корреляции с подтвержденными in vitro значениями составил 0,70 и 0,59, соответственно, по сравнению с 0,93, наблюдаемыми с результатами TRAM (дополнительный файл 8). Это лучше подходит за счет дополнительной ручной настройки на начальных этапах настройки анализа TRAM, что не требуется для атласов, автоматически поддерживаемых в веб-среде; аналогичные результаты были получены при поиске в BioGPS [44] (данные не показаны). В случае TRAM значения меньше коррелируют с экспериментально определенной мерой при приближении к нижнему пределу обнаружения, как и ожидалось, из-за основанной на гибридизации природы платформ микрочипов.

Наконец, стоит отметить, что этот эффективный и проверенный количественный подход к определению значений эталонной экспрессии для локусов, выраженных в транскриптоме, распространяется на способность TRAM обеспечивать анализ на основе хромосомных областей путем поиска статистически значимой избыточной / недостаточной экспрессии. геномных сегментов, не на основе простого обогащения в сегменте избыточно / недоэкспрессированных генов, содержащихся в сегменте, а на фактическом определении значения экспрессии для всего геномного сегмента, полученного путем суммирования количественных значений экспрессии генов, содержащихся в Это.

Поиск референсных генов для изучения экспрессии генов в щитовидной железе человека

Наличие представленной здесь систематической и подробной карты экспрессии для щитовидной железы стало прекрасным поводом для исследования, среди многих особенностей транскриптома, пригодности отдельных генов как лучшие стабильные эталонные гены для нормализации данных в исследованиях экспрессии генов.

Добавить комментарий Отменить ответ

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Комментарий

Имя *

Email *

Сайт