Хромосома ген днк: Молекула ДНК человека. Как работают гены, что такое РНК, нуклеотиды, синтез белка :: Polismed.com – ДНК. Основные понятия.

Содержание

Разговор об основах генетики (часть 3

Введение

Когда в середине 19 века первый на свете генетик Грегор Мендель открывал свои законы, он ничего не знал о том, что такое хромосомы и гены, и поэтому был вынужден обходиться довольно абстрактным термином «наследственный признак».

В начале 20 века американский ученый Томас Морган доказал, что гены, определяющие наследственные признаки, находятся именно в хромосомах. В лаборатории Моргана было тщательно описано поведение хромосом, включая сцепленность многих генов, а также кроссинговер — обмен хромосом участками. Этот обмен является основой генетической рекомбинации (об этом важнейшем для генетики и селекции явлении у нас запланирована отдельная публикация).

Однако только к середине 20 века стало окончательно понятно, что гены располагаются в молекулах ДНК, являющихся основой хромосом. С этого момента началась эпоха молекулярной биологии и современной генетики, и конца этой эпохи не видно! Поэтому для понимания базовых генетических процессов важно понимать, как устроены гены в ДНК хромосом.

Что такое хромосомы?

Изначально хромосомы наблюдали под микроскопом в делящихся клетках. Хромосомы располагаются в ядре клетки, удваиваются перед делением и поровну распределяются между дочерними клетками. Основу каждой хромосомы образует одна длинная молекула ДНК, в которой записаны гены, как слова в книге. Каждая хромосома — это отдельная книга со своим набором слов (генов).

Молекула ДНК в хромосоме тщательно свернута и связана с огромным количеством белков, которые помогают копировать ДНК перед делением клетки, а также регулируют активность генов.

В клетках организма каждая хромосома представлена в двух экземплярах, один из которых достался от отца, а другой — от матери, так сказать, две резервные копии. У человека 23 пары хромосом, у кошки – 19 пар, а у собаки – 39 пар.

Что такое ДНК?

ДНК (ДезоксирибоНуклеиновая Кислота ) — это очень длинная линейная полимерная молекула. Например, общая длина ДНК всех 46 хромосом в каждой клетке человека составляет около двух метров!

Молекула ДНК в составе каждой хромосомы состоит из двух нитей, которые, переплетаясь между собой, формируют двойную спираль, структура которой была определена в 1953 году английскими учеными Джеймсом Уотсоном и Френсисом Криком на основе экспериментального материала другого английского ученого — Розалинд Франклин.

Как происходит взаимодействие нитей в молекуле ДНК и почему это важно? Формирование двойной спирали определяется взаимодействием специальных химических групп в составе каждой нити ДНК. Эти группы называются азотистыми основаниями и именно они формируют алфавит ДНК, который используется генетическим кодом (о том, что такое генетический код, будет подробно рассказано в одной из следующих статей).

К счастью, азотистые основания в ДНК любого организма на нашей планете бывают всего четырех типов: аденин (A), гуанин (G), тимин (T) и цитозин (C). Азотистые основания способны формировать взаимодействия: A-T и G-C, а другие комбинации невозможны. Этот закон называется принципом комплементарности.

Таким образом, если на одной нити ДНК находится A, то в нити напротив — всегда T, а если G, то на второй нити — C. Таким образом, последовательность букв ДНК-алфавита в одной цепи однозначно соответствует последовательности букв во второй цепи, а сама ДНК начинает напоминать застежку-молнию, например:

A-T
T-A
G-C
A-T
G-C
T-A

Взаимодействия между азотистыми основаниями играют ключевую роль в генетической наследственности. Перед делением клетки каждая хромосома удваивается. При этом двойная спираль ДНК расплетается и напротив каждой нити специальными ферментами достраивается новая нить, с соблюдением правила комплементарности. Таким образом получаются две копии ДНК, которые при делении передаются в две новые клетки. Этот процесс называется репликацией.

Что такое гены?

Проще всего сравнить гены со словами, записанными алфавитом ДНК из 4 букв: A, T, G и C. Как и в современной литературе, не любая последовательность букв ДНК имеет смысл, так что ген — это полноценное осмысленное слово, у которого есть начало, конец и, что самое главное — значение. Значение гена — это его биологическая функция. Как эта функция осуществляется, мы обсудим в статье про генетический код.

Так, у собаки в настоящее время известно в общей сложности 20199 генов, у кошки – 19563 гена (по данным портала https://www.ensembl.org). Именно эти гены определяют, как будет построен организм, со всем разнообразием образующих его клеток.

что это такое и как они работают. Что такое хромосомы?

Ген – это наследственный фактор, в котором зашифрован определенный признак организма. Физически ген представляет собой участок ДНК (реже – РНК), который задает последовательность белков либо функциональной РНК. Совокупность генов в организме называют генотипом, а науку о генах – генетикой.

Всё началось с гороха

Аббат Грегор Мендель, австрийский ботаник и биолог, заметил, что потомство не всегда повторяет признаки, которыми обладали родители. Чтобы понять взаимосвязь, Мендель стал выращивать горох, скрещивать различные растения и отслеживать частоту наследования признаков.

Мендель доказал, что отдельные признаки (цвет, форма цветка и т.д.) могут наследоваться независимо. Он вывел теорию доминантных и рецессивных признаков, описал явление прерывистого наследования, математически интерпретировал результаты своих экспериментов.

Труды Менделя впервые опубликовали в 1866 году. Именно его считают основоположником генетики.

До этого ученые считали, что родительские признаки смешиваются подобно жидкости и потомки наследуют именно такой «коктейль». Теория пангенезиса, которую Чарльз Дарвин сформулировал в 1868 году, также следует этой концепции.

Впрочем, Дарвин считал, что «коктейль» состоит из мельчайших отдельных частиц – геммул. Они смешиваются во время зачатия. В целом ученый был недалек от истины.

Собственно термин «ген» в 1909 году ввел Вильгельм Йоханнсен. До этого признаки называли пангенами.

ДНК как носитель генов

В 1940-е годы американский биолог Освальд Эвери из Рокфеллеровского института доказал, что дезоксирибонуклеиновая кислота, которая присутствует в ядре клетки, является физическим носителем генетической информации. В экспериментах с пневмококками он установил, что только ДНК, а не белок или другие компоненты, передает признаки от бактерий к их наследникам.

Первые фото ДНК удалось получить только в 1953 году Розалинд Франклин и Морису Уилкинсу. На их основе Джеймс Д. Уотсон и Фрэнсис Крик разработали модель молекулы двухцепочечной спирали ДНК, а также сформулировали теорию генетической репликации – создания двух дочерних ДНК от материнской клетки.

Всё это привело к появлению главной догмы молекулярной биологии. РНК (рибонуклеиновая кислота, одинарная цепочка) транскрибируется с ДНК: ДНК выступает в качестве базы, с которой на РНК переносится информация. При этом белки транслируются с РНК. Обратный процесс (когда ДНК создается по РНК) происходит только в некоторых вирусах, например, в ВИЧ (вирусе иммунодефицита человека).

ДНК состоит из четырех различных нуклеотидов: аденина (А), цитозина (Ц), гуанина (Г) и тимина (Т). Они образуют спаренные основания: ЦГ, АТ, ГЦ, ТА. Противоположные основания в спирали ДНК связаны водородными связями.

Что такое хромосомы

Хромосома образуется из очень длинной молекулы ДНК, которая содержит повторяющиеся цепочки генов. У каждого вида свой набор хромосом (кариотип). Например, у человека 46 хромосом: 22 пары аутосом разной длины и пара половых хромосом – XX или XY.

В геноме человека насчитывается 20-25 тыс. генов. Если молекулу ДНК из самой длинной хромосомы расположить вдоль линии, она займет около 1,5 м. Длина отдельного участка ДНК, который кодирует ген, составит всего 0,005 мм.

Место хранения определенного гена в хромосоме называют локусом. В каждом локусе – определенный аллель гена, одна из нескольких его форм.

Аллели могут быть одинаковыми – тогда говорят, что организм гомозиготный. Если аллели разные, то один из них главенствует, доминирует над другим. Доминантный ген подавляет рецессивный. В результате проявляется только один признак, но наследуются оба.

Набор хромосом и аллелей генов в них определяет наш внешний вид, физические и психические данные. Это база, которую затем изменяют природа, среда, образ жизни и т.д.

Как работают гены

Гены можно разделить на две группы – структурные и регуляторные. В структурных генах хранится информация о полипептидных цепях – это собственно признаки. Регуляторные, или функциональные гены включают и выключают структурные гены.

Назначение структурного гена в любом организме – в нужный момент обеспечить появление в клетке белка, который он кодирует. Чтобы это произошло, задействуются различные части гена.

Так, промотор, который находится перед белок-кодирующей частью, задает основные характеристики активности гена. Промотор определяет, в каких клетках будет работать ген, насколько долго и с какой интенсивностью. В конце гена находится терминатор – это сигнал конца цепочки.

РНК-полимераза проходит путь от промотора до терминатора и выполняет синтез матричной РНК – своеобразной инструкции для синтеза белка, правильного расположения в нем нужных аминокислот. Этот процесс называют транскрипцией.

Регуляторные гены – это гены-регуляторы и гены-операторы. Оператор непосредственно связан с определенной группой структурных генов (и такая конструкция называется «оперон»). Регулятор через белок-репрессор воздействует на структурные гены и обеспечивает синтез белка – трансляцию.

В синтезе белка участвует два десятка аминокислот. Каждые три нуклеотида ДНК кодируют определенную аминокислоту. Трансляция происходит на базе РНК-копии гена из ДНК:

  1. Матричная РНК выходит из ядра клетки в цитоплазму и связывается с рибосомой.

  2. В рибосоме синтезируется РНК-копия гена по инструкции из матричной РНК. Затем у этой РНК-копии будет синтезироваться белок.

  3. Из РНК-копии удаляются нитроны – нуклеотиды, которые не нужны для синтеза белка.

  4. Оперон начинает реакцию по синтезу белка. Пока молекул белка недостаточно, белок-репрессор неактивен.

  5. Как только накопилось достаточно молекул синтезируемого белка, белок-репрессор активируется.

  6. Он связывается с геном-оператором.

  7. После связывания синтез белка прекращается.

Что такое мутация

При репликации (копировании) ДНК очень редко, но всё же могут возникать ошибки. Их называют мутациями. Ученые подсчитали, что представитель каждого нового поколения несет в своем геноме 1-2 новых мутации.

Обычно мутации возникают из-за повреждения ДНК в процессе копирования. Они могут привести к хромосомным аномалиям: когда достаточно большие участки хромосомы дублируются, удаляются или перегруппируются.

В результате мутаций белки начинают синтезироваться неправильно. В целом в организмах есть механизмы «ремонта» ДНК после мутаций или уничтожения клеток-мутантов, но они не всегда срабатывают.

Если мутации происходят в половой клетке, у плода могут неправильно сформироваться целые органы и системы. Если в обычной клетке, то могут появиться доброкачественные или злокачественные образования.

С другой стороны, отдельные мутации оказывались удачными. Они сыграли важную роль в процессе естественного отбора и привели к созданию более выносливых и приспособленных организмов.

Знакомые незнакомцы: внехромосомные кольцевые ДНК

В истории молекулярной биологии многие открытия сначала опережают время, а потом долгие годы остаются незаслуженно забытыми, пока накопившиеся в области геномики и других «-омик» данные не приведут к их повторному «переоткрытию». Так случилось и с внехромосомной кольцевой ДНК, которая описана у большинства эукариот, а у человека известна с 60-х годов прошлого века. В последнее время этот ранее неизученный пул нуклеиновых кислот привлек внимание ученых, поскольку выяснилось, насколько весомым является их вклад в патогенез онкологических заболеваний. Позволит ли внехромосомная кольцевая ДНК собрать опухолевый пазл в единую картину? Только ли для опухолей характерно ее присутствие? О некоторых аспектах биологии внехромосомных кольцевых ДНК мы и поговорим в этом обзоре.

Минихромосомы

Рисунок 1. Цитогенетический препарат клетки нейробластомы с присутствующими на нем 16-ю двойными минихромосомами. Опубликовано в журнале Lancet, 1965 год.

Кольцевые ДНК описаны у вирусов, прокариот, низших эукариот (дрожжей, простейших и грибов), а также у некоторых высших растений. У млекопитающих, в том числе у человека, кольцевые ДНК присутствуют в составе митохондриального генома. Весь остальной геном, как считалось, в норме представлен линейными хромосомами и только в опухолях были описаны крупные внехромосомные кольцевые ДНК, которые удавалось наблюдать, изучая образцы новообразований в световом микроскопе (рис. 1).

Эти структуры получили название double minutes (от лат. minutus — маленький, мелкий) — двойные минихромосомы [1]. От обычных хромосом они отличаются не только кольцевой формой и размером, но и тем, что не имеют центромеры.

Впоследствии предложили методы, позволяющие отделить пул кольцевых ДНК от основной массы ДНК с помощью центрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия или специфических экзонуклеаз и двумерного гель-электрофореза. Но, как и в случае с кольцевыми РНК (о которых «Биомолекула» писала в [2]), только в последнее время, с развитием технологии секвенирования нового поколения и разработкой биоинформатических подходов для поиска кольцевых молекул, удалось изучить всё их многообразие, ограничивающееся далеко не только двойными минихромосомами.

Четкой номенклатуры внехромосомных кольцевых ДНК, или вкДНК (extrachromosomal circular DNA, eccDNA), пока нет, но сегодня известно о существовании их вариантов размерами от сотен пар нуклеотидов (например, микроДНК, состоящей из 200–400 п.н.) до нескольких миллионов. Внехромосомная кольцевая ДНК может содержать повторяющиеся участки (как, скажем, теломерная или рибосомная ДНК) или состоять из уникальных, неповторяющихся последовательностей. Кольцевая ДНК упакована не столь плотно, как в хромосомах, что играет важную регуляторную роль, так как облегчает доступ к хроматину и способствует транскрипции определенных генов [3].

Точное число всех внехромосомных кольцевых ДНК, присутствующих в клетках, подсчитать достаточно сложно: методы секвенирования для количественного учета не годятся, а флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), позволяющая локализовать в клетках любые последовательности ДНК, характеризуется высоким уровнем «шума». Малый размер и отсутствие четких морфологических «опознавательных знаков» вкДНК еще более затрудняют их идентификацию при FISH.

Совсем недавно на базе нейронной сети U-Net, широко применяющейся при анализе и обработке биомедицинских изображений, была создана программа ecSeg, позволяющая подсчитывать количество внехромосомных кольцевых ДНК в образцах различных клеточных линий [4]. Программа работает с изображениями, получаемыми камерой флуоресцентного микроскопа с метафазных пластинок, окрашенных DAPI (ДНК-связывающимся флуорофором). Проанализировав сорок различных опухолевых клеточных линий человека, создатели программы обнаружили, что некоторые из них (например, клеточная линия рака молочной железы HCC1569) содержат более 100 различных внехромосомных кольцевых ДНК в каждой клетке. Причем вариабельность вкДНК внутри одной и той же клеточной линии обеспечивается уже при их содержании в каждой клетке в количестве всего 10 единиц (и более). Это говорит о той важной роли, которую играет количество вкДНК в повышении неоднородности клеточной популяции.

Умножай и властвуй

Но вернемся к самым известным представителям внехромосомных кольцевых ДНК — двойным минихромосомам. Предполагается, что их появлению в клетке предшествует амплификация (многократное увеличение числа копий) определенных генов. В дальнейшем амплифицированные участки «вырезаются» из хромосомы и закольцовываются. Так, двойные минихромосомы клеток нейробластом (злокачественных опухолей симпатической нервной системы) содержат амплифицированный ген MYCN. Экстрахромосомная амплификация KRAS наблюдается в аденокарциномах пищевода, пищеводно-желудочного перехода и желудка, а также в некоторых случаях колоректального рака. Внехромосомная амплификация гена циклина D1 описана при раке мочевого пузыря [5]. Как правило, каждая кольцевая минихромосома состоит из амплифицированных копий только одного онкогена, хотя есть и исключения: так, описаны внехромосомные кольцевые ДНК с одновременной амплификацией генов EGFR и CDK4 [6]. Средний размер ампликона (участка ДНК, являющегося результатом амплификации) составляет 1,26 миллиона пар нуклеотидов [3], поэтому неудивительно, что двойные минихромосомы достаточно крупны (хоть это и звучит как каламбур).

В дальнейшем кольцевые структуры, несущие амплифицированный онкоген, могут встраиваться в хромосому, причем в произвольно выбранной позиции. В этом случае они формируют на хромосоме гомогенно окрашенные участки (ГОУ; в англоязычной литературе — homogenous staining regions, HSR), представляющие собой цитогенетическое проявление амплификации (рис. 2).

Двойные минихромосомы могут приводить к появлению ГОУ

Рисунок 2. Двойные минихромосомы могут приводить к появлению ГОУ при встраивании в один и тот же участок на хромосоме или распределяться случайным образом, встраиваясь в разные участки разных хромосом

Отсутствие центромер приводит к тому, что в процессе митоза двойные минихромосомы, в отличие от обычной хромосомной ДНК, распределяются между дочерними клетками случайным образом. Поскольку амплификация онкогенов придает опухолевой клетке преимущество в скорости роста по сравнению с соседями, те из них, что содержат большее количество внехромосомных кольцевых ДНК, приобретают пролиферативное преимущество и проходят, таким образом, положительный отбор в ходе эволюции опухоли [7].

Рассматривая прогрессию опухоли через призму дарвиновской эволюции, можно объяснить и альтернативный вариант — полное исчезновение двойных минихромосом из клетки. Например, при таргетном лечении трастузумабом рака молочной железы (РМЖ) с амплификацией гена Her2/neu примерно у одной трети больных возникает рецидив [8]. Механизмов развития резистентности к таргетной терапии существует много, но один из вариантов заключается в активации работы сигнальных каскадов, перекрывающихся с сигнальным путем Her2/neu, с помощью компенсирующей амплификации генов PIK3CA и c-Met [8], [9]. Так, при лечении трастузумабом метастатического РМЖ с амплификацией Her2/neu в 27,7% случаев обнаруживается и амплификация гена рецептора тирозинкиназы c-Met [10]. Амплификация с-Met берет на себя функцию драйверной, а кольцевые минихромосомы, несущие амплифицированный ген Her2/neu, становятся балластом: они элиминируются из клетки.

На примере появления резистентных к трастузумабу клеток и прогрессии РМЖ, несмотря на лечение, хорошо видно, почему ингибирование только одной молекулярной мишени может оказаться терапевтически неэффективным. Стратегическим направлением клинических исследований сейчас становится воздействие сразу на несколько мишеней (double-hit-лечение). Так, по сравнению с обычной таргетной терапией при немелкоклеточном раке легкого с мутациями гена EGFR, использование комбинированной терапии бевацузимабом и эрлотинибом увеличивает время до прогрессирования заболевания и общую выживаемость больных [11]. Комбинация различных препаратов используется и при лечении меланомы c мутацией в гене BRAF [12]. К сожалению, ни в одном из исследований не описана какая-либо комбинация препаратов, которая бы привела к полному излечению пациентов. Во всех случаях неизбежно развивается резистентность, правда, в более поздние сроки по сравнению с монотерапией.

Пассажир садится за руль

Гены, которые подвергаются амплификации, находятся, как правило, в начале сигнальных каскадов, регулирующих важнейшие клеточные процессы, такие как рост клеток и поддержание целостности и функциональной дееспособности генома. Эти гены являются драйверами процесса канцерогенеза, то есть играют решающую роль в развитии опухоли. Учитывая, что процесс образования кольцевых структур может быть опосредован репарацией двухцепочечных разрывов с помощью негомологичного соединения концов линейной ДНК (non-homologous end joining, NHEJ) — процесса неточного и потенциально ведущего к накоплению мутаций, — можно ожидать, что мутационная нагрузка на вкДНК окажется выше, чем на остальные части опухолевого генома. И действительно, оказалось, что амплификация с образованием внехромосомной кольцевой ДНК может сопровождаться вторичными мутациями, которые изначально не влияют на рост опухоли (за что и получили название «мутации-“пассажиры”»), но способны выступать как потенциальные драйверы опухолевой прогрессии при изменении условий внешней среды, например, если опухоль подвергнется лечению.

Ярким примером того, как мутации-«пассажиры» на внехромосомных кольцевых ДНК, накапливаемые «про запас», обеспечивают дополнительный механизм адаптации опухоли в новых условиях существования, является возникновение резистентности к лечению ингибиторами тирозинкиназы в глиобластомах (злокачественных опухолях головного мозга) с делецией 16 экзона в РНК-транскрипте гена EGFR (EGFRxE16) (рис. 3) [13].

Молекулярный профиль внехромосомных кольцевых ДНК опухоли

Рисунок 3. Молекулярный профиль внехромосомных кольцевых ДНК опухоли в момент постановки диагноза и после обнаружения рецидива. В каждой из кольцевых минихромосом возможно возникновение дополнительных мутаций (обозначены кружками различных оттенков). вкДНК, несущие ген EGFR дикого типа (wtEGFR), отмечены черными кружками. Кольцевые минихромосомы с мутацией EGFRvIII — синего цвета, с мутацией EGFRxE16 — красного. Объяснения см. в тексте.

В клетках глиобластом возможны несколько различных мутаций гена EGFR. В случае мутации EGFRvIII, которая возникает в результате делеции экзонов 2–7 гена EGFR, опухоль, как и при наличии EGFR «дикого типа», остается чувствительной к терапии ингибиторами тирозинкиназы EGFR, такими как эрлотиниб и др. Напротив, опухоли, содержащие кольцевые минихромосомы с мутацией EGFRxE16, приобретают резистентность к проводимой терапии. Находясь в небольшом количестве клеток опухоли в момент постановки диагноза, с каждым поколением клеток кольцевые минихромосомы с мутацией EGFRxE16 накапливаются и дают начало новому опухолевому клону, преуспевшему в изменившихся условиях окружающей среды больше остальных. Отбор наиболее приспособленных — движущая сила эволюции, и здесь эволюция внутри опухоли поразительно напоминает классическую дарвиновскую эволюцию, предопределяя то обстоятельство, что возникающий через некоторое время рецидив будет представлен именно клоном с мутацией EGFRxE16 на внехромосомной кольцевой ДНК. Другой путь эволюции глиобластом — потеря двойных микрохромосом с мутантным EGFR, что тоже повышает устойчивость к лекарственным препаратам, усиливает злокачественный потенциал опухолевой популяции и объясняет плохой прогноз при данном заболевании [14].

Когда замкнутость дает преимущества

Возникновение амплификаций и вторичных по отношению к ним точечных мутаций за пределами хромосом имеет глубокий биологический смысл. Так опухоли получают возможность «экспериментировать» с новыми функциями, не нарушая свою жизнедеятельность. К тому же, с помощью амплификаций и других мутаций кольцевой внехромосомной ДНК формируется генетическая гетерогенность (разнородность) опухоли, а процесс ее эволюции идет гораздо быстрее, чем если бы эти процессы происходили исключительно в хромосомах. Это было показано Кристен Тёрнер и ее соавторами с помощью методов математического моделирования [15]. Они обнаружили, что внехромосомная амплификация позволяет достичь более высокого уровня экспрессии онкогена благодаря неравному распределению кольцевой ДНК между дочерними клетками во время митоза. Как и было предсказано моделью, в опухолях, где отмечалось присутствие вкДНК, содержание онкогенов EGFR (включая EGFRvIII) и MYC было значительно более высоким по сравнению с теми, которые не задействовали механизм внехромосомной амплификации. Авторы исследования также пришли к выводу, что если онкоген амплифицируется интрахромосомно, гетерогенность опухоли остается на сравнительно низком уровне.

Существование гетерогенности в опухоли может иметь большое клиническое значение, так как оказывает влияние на развитие заболевания и во многом определяет ответ на лечение [15], [16]. Представим себе опухолевые клетки с полностью идентичным геномом за исключением качественного и количественного спектра внехромосомных кольцевых ДНК. Уже только за их счет опухоль обеспечивает себе огромное разнообразие генотипических и фенотипических вариантов, и высока вероятность, что хотя бы один из них преуспеет больше остальных при изменении условий окружающей среды. Если учесть, что в реальных условиях in vivo опухоль является внутренне гетерогенной за счет генных мутаций и эпигенетических изменений, а также за счет влияния внешних факторов (таких как микроокружение опухоли), то вкДНК делает процесс опухолевой эволюции еще более сложным, приводя к прогрессии заболевания и неудачам в лечении.

На что способна кольцевая ДНК?

Важное открытие последних лет состоит в том, что в неопухолевых клетках также присутствуют внехромосомные кольцевые ДНК. Так, в 2018 году сразу две исследовательские группы продемонстрировали существование вкДНК в здоровых тканях человека [17], [18].

Молекулы кольцевой ДНК, обнаруженные в нормальных клетках, сильно различаются по размеру и генному составу. Часть из этих внехромосомных структур очень мала (менее 25 т.п.н.), другие же достигают 1 миллиона пар нуклеотидов, что сравнимо с двойными минихромосомами опухолей. Надо особо подчеркнуть, что сравнимы внехромосомные кольцевые ДНК опухолевой и нормальной тканей могут быть только по размеру, но не по структуре — в норме амплификации генов на внехромосомной ДНК не происходит.

В составе «нормальной» вкДНК обнаруживаются целые гены и их отдельные участки, межгенные промежутки, повторяющиеся последовательности, ретровирусы, ретротранспозоны, длинные терминальные повторы (LTR) и т.д. Ученые предполагают, что это продукты удаленной из хромосом поврежденной ДНК, которая не сразу элиминируется из клетки, а продолжает существовать в нестабильной кольцевой форме. Был даже предложен новый термин «циркулóм», обозначающий совокупность дополнительных внехромосомных кольцевых молекул ДНК [17]. Интересно, что хромосомы, содержащие наибольшее количество генов, являются и источником самого большого количества внехромосомных кольцевых ДНК [18].

Какую роль может играть эта ДНК в нормальной, неопухолевой клетке? Для ответа на этот вопрос ученым может пригодиться CRISPR/Cas — самая нашумевшая технология последних лет, о которой «Биомолекула» неоднократно писала [19–22].

Технология CRISPR сделала возможным эндогенный биогенез внехромосомной кольцевой ДНК в культуре клеток. Эксперименты были проведены на человеческих клетках почки эмбриона (HEK293T) и фибробластах молочной железы человека (HMF). Но принцип метода универсален и подходит для любых клеточных культур: нужны лишь два различных рибопротеиновых комплекса CRISPR/Cas9, вносящие в ДНК одной и той же хромосомы два двухцепочечных разрыва, а далее дело за клеточной системой репарации NHEJ, превращающей вырезанный кусок в кольцо. С помощью этой технологии была продемонстрирована гипотетическая ранее транскрипционная активность внехромосомной кольцевой ДНК [23]. Показано, что с вкДНК транскрибируются не только мРНК, но и малые некодирующие РНК — микроРНК и короткие интерферирующие РНК, которые могут подавлять экспрессию генов в клетках на уровне трансляции посредством РНК-интерференции [24]. Интересно, что эти линейные молекулы РНК содержат соединительные последовательности, характерные в то же время и для кольцевой РНК, что может привести к потенциальным ошибкам при биоинформатическом анализе данных секвенирования [25]. Поэтому при работе с кольцевой РНК необходимо подтверждать данные РНК-секвенирования (полученные методами «сухой» биологии) с помощью РНК-азы R, нозерн-блоттинга или электрофоретически. Сами же химерные линейные РНК, содержащие соединительные последовательности, характерные для бэксплайсинга (от англ. backsplicing — процесс сплайсинга с последующим соединением концов вырезанного транскрипта «голова к хвосту»), следует рассматривать как еще один тип молекул РНК, которые, возможно, выполняют в организме те же функции, что и кольцевые РНК, и потому заслуживают прицельного изучения.

Транскрипционной регуляцией экспрессии генов функции внехромосомной кольцевой ДНК не ограничиваются. Подобно экзосомам, она может выполнять роль переносчиков генетической информации от клетки к клетке. Межклеточные взаимодействия — это универсальный по своей природе биологический механизм, который лежит в основе существования всех многоклеточных. Процессы межклеточной коммуникации с особым вниманием изучают онкологи, так как, к сожалению, опухоли используют те же самые механизмы коммуникации, что и здоровые клетки. Уже накоплены данные о том, что вкДНК может репрограммировать микроокружение опухоли, участвовать в формировании преметастатических ниш, супрессивно модулировать иммунные клетки, тем самым определяя развитие опухолевого процесса и прогноз заболевания [3], [15–17].

Не менее интересно возможное участие внехромосомных кольцевых ДНК в регуляции иммунных процессов в клетке. Известно, что в ответ на появление молекул ДНК в цитоплазме клетка активирует cGAS — синтазу 2′-3′-циклического ГМФ-АМФ, — что запускает сигнальный каскад, кульминацией которого является продукция интерферона и других медиаторов воспаления . Таков иммунный ответ на внешние патогены.

При попадании в цитоплазму внехромосомная кольцевая ДНК, если она не подвергается деградации ферментами, такими как TREX1 , тоже способна запускать cGAS-каскад, действуя, таким образом, как эндогенный антиген, активирующий аутоиммунные пути в клетке.

Перспективы использования внехромосомной кольцевой ДНК в медицине

Внехромосомная кольцевая ДНК, подобно линейным «осколкам» хромосом, может попадать не только в цитоплазму, но и в кровяное русло. Опухоли участвуют в этом процессе не менее активно, чем здоровые ткани (рис. 4).

Источники ДНК для жидкостной биопсии

Рисунок 4. Источником ДНК для жидкостной биопсии могут быть линейные «осколки» хромосом и внехромосомная кольцевая ДНК, а также экзосомы, циркулирующие опухолевые клетки и клетки нормальных тканей, попадающие в кровяное русло

Количество внехромосомной кольцевой ДНК в крови не всегда коррелирует с размерами опухоли, но также зависит и от ее пролиферативной активности, васкуляризации, скорости деградации и других факторов. К тому же, необходимо помнить, что источником внехромосомной кольцевой ДНК в крови служат не только опухолевые, но и нормальные клетки. Но поскольку вкДНК опухолей обычно больше по размеру, это создает потенциальную возможность использования жидкостной биопсии для определения их динамики при хирургическом и лекарственном лечении злокачественных новообразований различной локализации [27]. Перспективным подходом является и оценка риска рецидива заболевания на основе выявляемых методом жидкостной биопсии закономерностей изменения численности внехромосомных кольцевых ДНК. Однако техническая сложность анализа минимальных различий размера вкДНК из здоровых и опухолевых клеток, необходимость минимизации ложно-положительных результатов и создания крайне чувствительного теста делают клиническое применение внехромосомной кольцевой ДНК опухолей как биомаркера для жидкостной биопсии делом отдаленного будущего. По крайней мере, эксперты американского общества клинической онкологии (ASCO) и коллегии американских патологов (CAP) по этому вопросу настроены скептически [28].

Более реальным выглядит создание лекарственного препарата, прицельно разрушающего внехромосомные кольцевые ДНК в опухолевых клетках и таким образом оказывающего терапевтическое воздействие. Так, уже появилось сообщение о том, что двуцепочечные разрывы, вносимые в структуру вкДНК с помощью CRISPR/Cas9, приводят к их агрегации, включению в состав микроядра и элиминации из клетки [29].

Заключение

Становится очевидным, что внехромосомные кольцевые ДНК играют важную роль в нормальных клетках и клетках опухолей. Будучи широко распространенными практически у всех эукариот, кольцевые ДНК участвуют в транскрипционной регуляции уровня экспрессии различных генов, процессах иммунного ответа, межклеточном взаимодействии и выполняют другие важные функции.

В опухолях же двойные минихромосомы можно рассматривать как резервуар для накопления различных амплификаций и точечных мутаций, причем все эти изменения, что немаловажно, являются обратимыми. Кольцевая ДНК обеспечивает высокую скорость накопления мутаций, которой не удается достичь в линейных хромосомах. И при этом клетка в любой момент может повернуть процесс вспять — если выяснится, что мутация несет потенциальный вред опухоли, вкДНК, ее содержащая, элиминируется из клетки. В конечном итоге именно внехромосомная кольцевая ДНК придает злокачественным новообразованиям пластичность, что делает лечение опухолей такой сложной задачей.

  1. David Cox, Catherine Yuncken, ArthurI. Spriggs. (1965). MINUTE CHROMATIN BODIES IN MALIGNANT TUMOURS OF CHILDHOOD. The Lancet. 286, 55-58;
  2. Власть колец: всемогущие кольцевые РНК;
  3. Sihan Wu, Kristen M. Turner, Nam Nguyen, Ramya Raviram, Marcella Erb, et. al.. (2019). Circular ecDNA promotes accessible chromatin and high oncogene expression. Nature. 575, 699-703;
  4. Utkrisht Rajkumar, Kristen Turner, Jens Luebeck, Viraj Deshpande, Manmohan Chandraker, et. al.. (2019). EcSeg: Semantic Segmentation of Metaphase Images Containing Extrachromosomal DNA. iScience. 21, 428-435;
  5. Ozkan Bagci, Serkan Kurtgöz. (2015). Amplification of cellular oncogenes in solid tumors. North Am J Med Sci. 7, 341;
  6. Ana C. deCarvalho, Hoon Kim, Laila M. Poisson, Mary E. Winn, Claudius Mueller, et. al.. (2018). Discordant inheritance of chromosomal and extrachromosomal DNA elements contributes to dynamic disease evolution in glioblastoma. Nat Genet. 50, 708-717;
  7. LUKÁŠ LACINA, MATÚŠ ČOMA, BARBORA DVOŘÁNKOVÁ, ONDŘEJ KODET, NIKOLA MELEGOVÁ, et. al.. (2019). Evolution of Cancer Progression in the Context of Darwinism. Anticancer Res. 39, 1-16;
  8. Debora de Melo Gagliato, Denis Leonardo Fontes Jardim, Mario Sergio Pereira Marchesi, Gabriel N. Hortobagyi. (2016). Mechanisms of resistance and sensitivity to anti-HER2 therapies in HER2+ breast cancer. Oncotarget. 7;
  9. Maria Luque-Cabal, Paula García-Teijido, Yolanda Fernández-Pérez, Luisa Sánchez-Lorenzo, Isabel Palacio-Vázquez. (2016). Mechanisms behind the Resistance to Trastuzumab in HER2-Amplified Breast Cancer and Strategies to Overcome It. Clin Med Insights Oncol. 10s1, CMO.S34537;
  10. Colan M Ho-Yen, J Louise Jones, Stephanie Kermorgant. (2015). The clinical and functional significance of c-Met in breast cancer: a review. Breast Cancer Res. 17;
  11. Takashi Seto, Terufumi Kato, Makoto Nishio, Koichi Goto, Shinji Atagi, et. al.. (2014). Erlotinib alone or with bevacizumab as first-line therapy in patients with advanced non-squamous non-small-cell lung cancer harbouring EGFR mutations (JO25567): an open-label, randomised, multicentre, phase 2 study. The Lancet Oncology. 15, 1236-1244;
  12. Ester Simeone, Antonio M. Grimaldi, Lucia Festino, Vito Vanella, Marco Palla, Paolo A. Ascierto. (2017). Combination Treatment of Patients with BRAF-Mutant Melanoma: A New Standard of Care. BioDrugs. 31, 51-61;
  13. Ke Xu, Liang Ding, Ti-Cheng Chang, Ying Shao, Jason Chiang, et. al.. (2019). Structure and evolution of double minutes in diagnosis and relapse brain tumors. Acta Neuropathol. 137, 123-137;
  14. David A. Nathanson, Beatrice Gini, Jack Mottahedeh, Koppany Visnyei, Tomoyuki Koga, et. al.. (2014). Targeted Therapy Resistance Mediated by Dynamic Regulation of Extrachromosomal Mutant EGFR DNA. Science. 343, 72-76;
  15. Kristen M. Turner, Viraj Deshpande, Doruk Beyter, Tomoyuki Koga, Jessica Rusert, et. al.. (2017). Extrachromosomal oncogene amplification drives tumour evolution and genetic heterogeneity. Nature. 543, 122-125;
  16. Roel G. W. Verhaak, Vineet Bafna, Paul S. Mischel. (2019). Extrachromosomal oncogene amplification in tumour pathogenesis and evolution. Nat Rev Cancer. 19, 283-288;
  17. Teressa Paulsen, Pankaj Kumar, M. Murat Koseoglu, Anindya Dutta. (2018). Discoveries of Extrachromosomal Circles of DNA in Normal and Tumor Cells. Trends in Genetics. 34, 270-278;
  18. Henrik Devitt Møller, Marghoob Mohiyuddin, Iñigo Prada-Luengo, M. Reza Sailani, Jens Frey Halling, et. al.. (2018). Circular DNA elements of chromosomal origin are common in healthy human somatic tissue. Nat Commun. 9;
  19. CRISPR-системы: иммунизация прокариот;
  20. CRISPR-эпопея и ее герои;
  21. От слов к делу: технологию CRISPR-Cas впервые применили для лечения онкозаболеваний;
  22. Разнообразие и эволюция систем CRISPR/Cas;
  23. Henrik Devitt Møller, Lin Lin, Xi Xiang, Trine Skov Petersen, Jinrong Huang, et. al.. (2018). CRISPR-C: circularization of genes and chromosome by CRISPR in human cells. Nucleic Acids Research;
  24. Teressa Paulsen, Yoshiyuki Shibata, Pankaj Kumar, Laura Dillon, Anindya Dutta. (2019). Small extrachromosomal circular DNAs, microDNA, produce short regulatory RNAs that suppress gene expression independent of canonical promoters. Nucleic Acids Research. 47, 4586-4596;
  25. Leire Iparraguirre, Iñigo Prada-Luengo, Birgitte Regenberg, David Otaegui. (2019). To Be or Not to Be: Circular RNAs or mRNAs From Circular DNAs?. Front. Genet.. 10;
  26. Почему прячут ДНК от Стинга?;
  27. Jing Zhu, Siyu Chen, Fan Zhang, Liang Wang. (2018). Cell-Free eccDNAs: A New Type of Nucleic Acid Component for Liquid Biopsy?. Mol Diagn Ther. 22, 515-522;
  28. Jason D. Merker, Geoffrey R. Oxnard, Carolyn Compton, Maximilian Diehn, Patricia Hurley, et. al.. (2018). Circulating Tumor DNA Analysis in Patients With Cancer: American Society of Clinical Oncology and College of American Pathologists Joint Review. JCO. 36, 1631-1641;
  29. Yoshihiro Oobatake, Noriaki Shimizu. (2019). Double‐strand breakage in the extrachromosomal double minutes triggers their aggregation in the nucleus, micronucleation, and morphological transformation. Genes Chromosomes Cancer;
  30. Takaaki Watanabe. (2013). Model Systems Facilitating an Understanding of Mechanisms for Oncogene Amplification. Oncogene and Cancer — From Bench to Clinic.

Дезоксирибонуклеиновая кислота — Википедия

Структура ДНК (двойная спираль). Различные атомы в структуре показаны в разных цветах; детальная структура двух пар оснований показана снизу справа

Дезоксирибонуклеи́новая кислота́ (ДНК) — макромолекула (одна из трёх основных, две другие — РНК и белки), обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. Молекула ДНК хранит биологическую информацию в виде генетического кода, состоящего из последовательности нуклеотидов[1]. ДНК содержит информацию о структуре различных видов РНК и белков.

В клетках эукариот (животных, растений и грибов) ДНК находится в ядре клетки в составе хромосом, а также в некоторых клеточных органеллах (митохондриях и пластидах). В клетках прокариотических организмов (бактерий и архей) кольцевая или линейная молекула ДНК, так называемый нуклеоид, прикреплена изнутри к клеточной мембране. У них и у низших эукариот (например дрожжей) встречаются также небольшие автономные, преимущественно кольцевые молекулы ДНК, называемые плазмидами. Кроме того, одно- или двухцепочечные молекулы ДНК могут образовывать геном ДНК-содержащих вирусов.

С химической точки зрения ДНК — длинная полимерная молекула, состоящая из повторяющихся блоков — нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания, сахара (дезоксирибозы) и фосфатной группы. Связи между нуклеотидами в цепи образуются за счёт дезоксирибозы и фосфатной группы (фосфодиэфирные связи). В подавляющем большинстве случаев (кроме некоторых вирусов, содержащих одноцепочечную ДНК) макромолекула ДНК состоит из двух цепей, ориентированных азотистыми основаниями друг к другу. Эта двухцепочечная молекула закручена по винтовой линии. В целом структура молекулы ДНК получила традиционное, но ошибочное название «двойной спирали», на самом же деле она является «двойным винтом». Винтовая линия может быть правой (A- и B-формы ДНК) или левой (Z-форма ДНК)[2].

В ДНК встречается четыре вида азотистых оснований (аденин (A), гуанин (G), тимин (T) и цитозин (C)). Азотистые основания одной из цепей соединены с азотистыми основаниями другой цепи водородными связями согласно принципу комплементарности: аденин (A) соединяется только с тимином (T), гуанин (G) — только с цитозином (C). Последовательность нуклеотидов позволяет «кодировать» информацию о различных типах РНК, наиболее важными из которых являются информационные, или матричные (мРНК), рибосомальные (рРНК) и транспортные (тРНК). Все эти типы РНК синтезируются на матрице ДНК за счёт копирования последовательности ДНК в последовательность РНК, синтезируемой в процессе транскрипции, и принимают участие в биосинтезе белков (процессе трансляции). Помимо кодирующих последовательностей, ДНК клеток содержит последовательности, выполняющие регуляторные и структурные функции. Кроме того, в геноме эукариот часто встречаются участки, принадлежащие «генетическим паразитам», например транспозонам.

Расшифровка структуры ДНК (1953 год) стала одним из поворотных моментов в истории биологии. За выдающийся вклад в это открытие Фрэнсису Крику, Джеймсу Уотсону и Морису Уилкинсу была присуждена Нобелевская премия по физиологии или медицине 1962 года. Розалинд Франклин, которая получила рентгенограммы, без которых Уотсон и Крик не имели бы возможность сделать выводы о структуре ДНК, умерла в 1958 году от рака (Нобелевскую премию не дают посмертно)[3].

ДНК как химическое вещество была выделена Иоганном Фридрихом Мишером в 1869 году из остатков клеток, содержащихся в гное. Он выделил вещество, в состав которого входят азот и фосфор. Вначале новое вещество получило название нуклеин, а позже, когда Мишер определил, что это вещество обладает кислотными свойствами, вещество получило название нуклеиновая кислота[4]. Биологическая функция новооткрытого вещества была неясна, и долгое время ДНК считалась запасником фосфора в организме. Более того, даже в начале XX века многие биологи считали, что ДНК не имеет никакого отношения к передаче информации, поскольку строение молекулы, по их мнению, было слишком однообразным и не могло содержать закодированную информацию.

До 1930-х годов считалось, что ДНК содержится только в животных клетках, а в растительных — РНК. В 1934 году в журнале «Hoppe-Seyler’s Zeitschrift fur physiologishe Chemie»[5], затем в 1935 году в «Ученых записках МГУ»[6] вышла статья советских биохимиков А. Н. Белозерского и А. Р. Кизеля в которых доказывалось присутствие ДНК в растительных клетках. В 1936 году группой Белозерского ДНК была выделена из семян и тканей бобовых, злаковых и других растений[7]. Результатом исследований этой же группы советских учёных в 1939 – 1947 годах стала первая в мировой научной литературе информация о содержании нуклеиновых кислот у различных видов бактерий.

Постепенно было доказано, что именно ДНК, а не белки, как считалось раньше, является носителем генетической информации. Одно из первых решающих доказательств принесли эксперименты Освальда Эвери, Колина Маклауда и Маклина Маккарти (1944 г.) по трансформации бактерий. Им удалось показать, что за так называемую трансформацию (приобретение болезнетворных свойств безвредной культурой в результате добавления в неё мёртвых болезнетворных бактерий) отвечает выделенная из пневмококков ДНК. Эксперимент американских учёных Алфреда Херши и Марты Чейз (эксперимент Херши — Чейз, 1952 г.) с помеченными радиоактивными изотопами белками и ДНК бактериофагов показали, что в заражённую клетку передаётся только нуклеиновая кислота фага, а новое поколение фага содержит такие же белки и нуклеиновую кислоту, как исходный фаг[8].

Вплоть до 50-х годов XX века точное строение ДНК, как и способ передачи наследственной информации, оставалось неизвестным. Хотя и было доподлинно известно, что ДНК состоит из нескольких цепочек, состоящих из нуклеотидов, никто не знал точно, сколько этих цепочек и как они соединены.

В результате работы группы биохимика Эрвина Чаргаффа в 1949—1951 гг. были сформулированы так называемые правила Чаргаффа. Чаргаффу и сотрудникам удалось разделить нуклеотиды ДНК при помощи бумажной хроматографии и определить точные количественные соотношения нуклеотидов разных типов. Соотношение, выявленное для аденина (А), тимина (Т), гуанина (Г) и цитозина (Ц), оказалось следующим: количество аденина равно количеству тимина, а гуанина — цитозину: А=Т, Г=Ц[9][10]. Эти правила, наряду с данными рентгеноструктурного анализа, сыграли решающую роль в расшифровке структуры ДНК.

Структура двойной спирали ДНК была предложена Френсисом Криком и Джеймсом Уотсоном в 1953 году на основании рентгеноструктурных данных, полученных Морисом Уилкинсом и Розалинд Франклин, и правил Чаргаффа[11]. Позже предложенная Уотсоном и Криком модель строения ДНК была доказана, а их работа отмечена Нобелевской премией по физиологии или медицине 1962 г. Среди лауреатов не было скончавшейся к тому времени от рака Розалинд Франклин, так как премия не присуждается посмертно[12].

Интересно, что в 1957 году американцы Александер Рич, Гэри Фелзенфелд и Дэйвид Дэйвис описали нуклеиновую кислоту, составленную тремя спиралями[13]. А в 1985—1986 годах Максим Давидович Франк-Каменецкий в Москве показал, как двухспиральная ДНК складывается в так называемую H-форму, составленную уже не двумя, а тремя нитями ДНК[14][15].

Нуклеотиды[править | править код]

Структуры оснований в составе ДНК

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) представляет собой биополимер (полианион), мономером которого является нуклеотид[16][17].

Каждый нуклеотид состоит из остатка фосфорной кислоты, присоединённого по 5′-положению к сахару дезоксирибозе, к которому также через гликозидную связь (C—N) по 1′-положению присоединено одно из четырёх азотистых оснований. Именно наличие характерного сахара и составляет одно из главных различий между ДНК и РНК, зафиксированное в названиях этих нуклеиновых кислот (в состав РНК входит сахар рибоза)[18]. Пример нуклеотида — аденозинмонофосфат, у которого основанием, присоединённым к фосфату и рибозе, является аденин (A) (показан на рисунке).

Исходя из структуры молекул, основания, входящие в состав нуклеотидов, разделяют на две группы: пурины (аденин [A] и гуанин [G]) образованы соединёнными пяти- и шестичленным гетероциклами; пиримидины (цитозин [C] и тимин [T]) — шестичленным гетероциклом[19].

В виде исключения, например, у бактериофага PBS1, в ДНК встречается пятый тип оснований — урацил ([U]), пиримидиновое основание, отличающееся от тимина отсутствием метильной группы на кольце, обычно заменяющее тимин в РНК[20].

Следует отметить, что тимин (T) и урацил (U) не так строго приурочены к ДНК и РНК соответственно, как это считалось ранее. Так, после синтеза некоторых молекул РНК значительное число урацилов в этих молекулах метилируется с помощью специальных ферментов, превращаясь в тимин. Это происходит в транспортных и рибосомальных РНК[21].

Двойная спираль[править | править код]

В зависимости от концентрации ионов и нуклеотидного состава молекулы, двойная спираль ДНК в живых организмах существует в разных формах. На рисунке представлены формы A, B и Z (слева направо)

Полимер ДНК обладает довольно сложной структурой. Нуклеотиды соединены между собой ковалентно в длинные полинуклеотидные цепи. Эти цепи в подавляющем большинстве случаев (кроме некоторых вирусов, обладающих одноцепочечными ДНК-геномами) попарно объединяются при помощи водородных связей во вторичную структуру, получившую название двойной спирали[11][18]. Остов каждой из цепей состоит из чередующихся фосфатов и сахаров[22]. Внутри одной цепи ДНК соседние нуклеотиды соединены фосфодиэфирными связями, которые формируются в результате взаимодействия между 3′-гидроксильной (3’—ОН) группой молекулы дезоксирибозы одного нуклеотида и 5′-фосфатной группой (5’—РО3) другого. Асимметричные концы цепи ДНК называются 3′ (три прайм) и 5′ (пять прайм). Полярность цепи играет важную роль при синтезе ДНК (удлинение цепи возможно только путём присоединения новых нуклеотидов к свободному 3′-концу).

Как уже было сказано выше, у подавляющего большинства живых организмов ДНК состоит не из одной, а из двух полинуклеотидных цепей. Эти две длинные цепи закручены одна вокруг другой в виде двойной спирали, стабилизированной водородными связями, образующимися между обращёнными друг к другу азотистыми основаниями входящих в неё цепей. В природе эта спираль, чаще всего, правозакрученная. Направления от 3′-конца к 5′-концу в двух цепях, из которых состоит молекула ДНК, противоположны (цепи «антипараллельны» друг другу).

Ширина двойной спирали составляет от 22 до 24 Å, или 2,2—2,4 нм, длина каждого нуклеотида 3,3 Å (0,33 нм)[23]. Подобно тому, как в винтовой лестнице сбоку можно увидеть ступеньки, на двойной спирали ДНК в промежутках между фосфатным остовом молекулы можно видеть рёбра оснований, кольца которых расположены в плоскости, перпендикулярной по отношению к продольной оси макромолекулы.

В двойной спирали различают малую (12 Å) и большую (22 Å) бороздки[24]. Белки, например, факторы транскрипции, которые присоединяются к определённым последовательностям в двухцепочечной ДНК, обычно взаимодействуют с краями оснований в большой бороздке, где те более доступны[25].

Образование связей между основаниями[править | править код]

Каждое основание на одной из цепей связывается с одним определённым основанием на второй цепи. Такое специфическое связывание называется комплементарным. Пурины комплементарны пиримидинам (то есть способны к образованию водородных связей с ними): аденин образует связи только с тимином, а цитозин — с гуанином. В двойной спирали цепочки также связаны с помощью гидрофобных взаимодействий и стэкинга, которые не зависят от последовательности оснований ДНК[26].

Комплементарность двойной спирали означает, что информация, содержащаяся в одной цепи, содержится и в другой цепи. Обратимость и специфичность взаимодействий между комплементарными парами оснований важна для репликации ДНК и всех остальных функций ДНК в живых организмах.

Так как водородные связи нековалентны, они легко разрываются и восстанавливаются. Цепочки двойной спирали могут расходиться как замок-молния под действием ферментов (хеликазы) или при высокой температуре[27]. Разные пары оснований образуют разное количество водородных связей. АТ связаны двумя, ГЦ — тремя водородными связями, поэтому на разрыв ГЦ требуется больше энергии. Процент ГЦ-пар и длина молекулы ДНК определяют количество энергии, необходимой для диссоциации цепей: длинные молекулы ДНК с большим содержанием ГЦ более тугоплавки[28].

Части молекул ДНК, которые из-за их функций должны быть легко разделяемы, например, ТАТА последовательность в бактериальных промоторах, обычно содержат большое количество А и Т.

Химические модификации азотистых оснований[править | править код]

Структура цитозина, 5-метилцитозина и тимина. Тимин может возникать путём деаминирования 5-метилцитозина

Азотистые основания в составе ДНК могут быть ковалентно модифицированы, что используется при регуляции экспрессии генов. Например, в клетках позвоночных метилирование цитозина с образованием 5-метилцитозина используется соматическими клетками для передачи профиля генной экспрессии дочерним клеткам. Метилирование цитозина не влияет на спаривание оснований в двойной спирали ДНК. У позвоночных метилирование ДНК в соматических клетках ограничивается метилированием цитозина в последовательности ЦГ[29]. Средний уровень метилирования отличается у разных организмов, так, у нематоды Caenorhabditis elegans метилирование цитозина не наблюдается, а у позвоночных обнаружен высокий уровень метилирования — до 1 %[30]. Другие модификации оснований включают метилирование аденина у бактерий и гликозилирование урацила с образованием «J-основания» в кинетопластах[31].

Метилирование цитозина с образованием 5-метилцитозина в промоторной части гена коррелирует с его неактивным состоянием[32]. Метилирование цитозина важно также для инактивации Х-хромосомы у млекопитающих[33]. Метилирование ДНК используется в геномном импринтинге[34]. Значительные нарушения профиля метилирования ДНК происходят при канцерогенезе[35].

Несмотря на биологическую роль, 5-метилцитозин может спонтанно утрачивать аминную группу (деаминироваться), превращаясь в тимин, поэтому метилированные цитозины являются источником повышенного числа мутаций[36].

Повреждения ДНК[править | править код]

Интеркалированное химическое соединение, которое находится в середине спирали — бензопирен, основной мутаген табачного дыма[37]

ДНК может повреждаться разнообразными мутагенами, к которым относятся окисляющие и алкилирующие вещества, а также высокоэнергетическая электромагнитная радиация — ультрафиолетовое и рентгеновское излучение. Тип повреждения ДНК зависит от типа мутагена. Например, ультрафиолет повреждает ДНК путём образования в ней димеров тимина, которые возникают при образовании ковалентных связей между соседними основаниями[38].

Оксиданты, такие как свободные радикалы или пероксид водорода, приводят к нескольким типам повреждения ДНК, включая модификации оснований, в особенности гуанозина, а также двухцепочечные разрывы в ДНК[39]. По некоторым оценкам, в каждой клетке человека окисляющими соединениями ежедневно повреждается порядка 500 оснований[40][41]. Среди разных типов повреждений наиболее опасные — это двухцепочечные разрывы, потому что они трудно репарируются и могут привести к потерям участков хромосом (делециям) и транслокациям.

Многие молекулы мутагенов вставляются (интеркалируют) между двумя соседними парами оснований. Большинство этих соединений, например: бромистый этидий, даунорубицин, доксорубицин и талидомид, имеет ароматическую структуру. Для того чтобы интеркалирующее соединение могло поместиться между основаниями, они должны разойтись, расплетая и нарушая структуру двойной спирали. Эти изменения в структуре ДНК мешают транскрипции и репликации, вызывая мутации. Поэтому интеркалирующие соединения часто являются канцерогенами, наиболее известные из которых — бензопирен, акридины, афлатоксин и бромистый этидий[42][43][44]. Несмотря на эти негативные свойства, в силу их способности подавлять транскрипцию и репликацию ДНК, интеркалирующие соединения используются в химиотерапии для подавления быстро растущих клеток рака[45].

Некоторые вещества (цисплатин[46], митомицин C[47], псорален[48]) образуют поперечные сшивки между нитями ДНК и подавляют синтез ДНК, благодаря чему используются в химиотерапии некоторых видов рака (см. Химиотерапия злокачественных новообразований).

Суперскрученность[править | править код]

Если взяться за концы верёвки и начать скручивать их в разные стороны, она становится короче и на верёвке образуются «супервитки». Так же может быть суперскручена и ДНК. В обычном состоянии цепочка ДНК делает один оборот на каждые 10,459 основания, но в суперскрученном состоянии спираль может быть свёрнута туже или расплетена[49]. Выделяют два типа суперскручивания: положительное — в направлении нормальных витков, при котором основания расположены ближе друг к другу; и отрицательное — в противоположном направлении. В природе молекулы ДНК обычно находятся в отрицательном суперскручивании, которое вносится ферментами — топоизомеразами[50]. Эти ферменты удаляют дополнительное скручивание, возникающее в ДНК в результате транскрипции и репликации[51].

Структура теломер. Зелёным цветом показан ион металла, хелатированный в центре структуры[52]

Структуры на концах хромосом[править | править код]

На концах линейных хромосом находятся специализированные структуры ДНК, называемые теломерами. Основная функция этих участков — поддержание целостности концов хромосом[53]. Теломеры также защищают концы ДНК от деградации экзонуклеазами и предотвращают активацию системы репарации[54]. Поскольку обычные ДНК-полимеразы не могут реплицировать 3′ концы хромосом, это делает специальный фермент — теломераза.

В клетках человека теломеры часто представлены одноцепочечной ДНК и состоят из нескольких тысяч повторяющихся единиц последовательности ТТАГГГ[55]. Эти последовательности с высоким содержанием гуанина стабилизируют концы хромосом, формируя очень необычные структуры, называемые G-квадруплексами и состоящие из четырёх, а не двух взаимодействующих оснований. Четыре гуаниновых основания, все атомы которых находятся в одной плоскости, образуют пластинку, стабилизированную водородными связями между основаниями и хелатированием в центре неё иона металла (чаще всего калия). Эти пластинки располагаются стопкой друг над другом[56].

На концах хромосом могут образовываться и другие структуры: основания могут быть расположены в одной цепочке или в разных параллельных цепочках. Кроме этих «стопочных» структур теломеры формируют большие петлеобразные структуры, называемые Т-петли или теломерные петли. В них одноцепочечная ДНК располагается в виде широкого кольца, стабилизированного теломерными белками[57]. В конце Т-петли одноцепочечная теломерная ДНК присоединяется к двухцепочечной ДНК, нарушая спаривание цепочек в этой молекуле и образуя связи с одной из цепей. Это трёхцепочечное образование называется Д-петля (от англ. displacement loop)[56].

ДНК является носителем генетической информации, записанной в виде последовательности нуклеотидов с помощью генетического кода. С молекулами ДНК связаны два основополагающих свойства живых организмов — наследственность и изменчивость. В ходе процесса, называемого репликацией ДНК, образуются две копии исходной цепочки, наследуемые дочерними клетками при делении, отсюда следует, что образовавшиеся клетки оказываются генетически идентичны исходной.

Генетическая информация реализуется при экспрессии генов в процессах транскрипции (синтеза молекул РНК на матрице ДНК) и трансляции (синтеза белков на матрице РНК).

Последовательность нуклеотидов «кодирует» информацию о различных типах РНК: информационных, или матричных (мРНК), рибосомальных (рРНК) и транспортных (тРНК). Все эти типы РНК синтезируются на основе ДНК в процессе транскрипции. Роль их в биосинтезе белков (процессе трансляции) различна. Информационная РНК содержит информацию о последовательности аминокислот в белке, рибосомальные РНК служат основой для рибосом (сложных нуклеопротеиновых комплексов, основная функция которых — сборка белка из отдельных аминокислот на основе иРНК), транспортные РНК доставляют аминокислоты к месту сборки белков — в активный центр рибосомы, «ползущей» по иРНК.

Структура генома[править | править код]

ДНК генома бактериофага: фотография под просвечивающим электронным микроскопом

Большинство природных ДНК имеет двухцепочечную структуру, линейную (эукариоты, некоторые вирусы и отдельные роды бактерий) или кольцевую (прокариоты, хлоропласты и митохондрии). Линейную одноцепочечную ДНК содержат некоторые вирусы и бактериофаги. Молекулы ДНК находятся in vivo в плотно упакованном, конденсированном состоянии[58]. В клетках эукариот ДНК располагается главным образом в ядре и на стадии профазы, метафазы или анафазы митоза доступны для наблюдения с помощью светового микроскопа в виде набора хромосом. Бактериальная (прокариоты) ДНК обычно представлена одной кольцевой молекулой ДНК, расположенной в неправильной формы образовании в цитоплазме, называемым нуклеоидом[59]. Генетическая информация генома состоит из генов. Ген — единица передачи наследственной информации и участок ДНК, который влияет на определённую характеристику организма. Ген содержит открытую рамку считывания, которая транскрибируется, а также регуляторные последовательности (англ.)русск., например промотор и энхансер, которые контролируют экспрессию открытых рамок считывания.

У многих видов только малая часть общей последовательности генома кодирует белки. Так, только около 1,5 % генома человека состоит из кодирующих белок экзонов, а больше 50 % ДНК человека состоит из некодирующих повторяющихся последовательностей ДНК[60]. Причины наличия такого большого количества некодирующей ДНК в эукариотических геномах и огромная разница в размерах геномов (С-значение) — одна из неразрешённых научных загадок[61]; исследования в этой области также указывают на большое количество фрагментов реликтовых вирусов в этой части ДНК.

Последовательности генома, не кодирующие белок[править | править код]

В настоящее время накапливается всё больше данных, противоречащих идее о некодирующих последовательностях как «мусорной ДНК» (англ. junk DNA). Теломеры и центромеры содержат малое число генов, но они важны для функционирования и стабильности хромосом[54][62]. Часто встречающаяся форма некодирующих последовательностей человека — псевдогены, копии генов, инактивированные в результате мутаций[63]. Эти последовательности нечто вроде молекулярных ископаемых, хотя иногда они могут служить исходным материалом для дупликации и последующей дивергенции генов[64]. Другой источник разнообразия белков в организме — это использование интронов в качестве «линий разреза и склеивания» в альтернативном сплайсинге[65]. Наконец, не кодирующие белок последовательности могут кодировать вспомогательные клеточные РНК, например мяРНК[66]. Недавнее исследование транскрипции генома человека показало, что 10 % генома даёт начало полиаденилированным РНК[67], а исследование генома мыши показало, что 62 % его транскрибируется[68].

Транскрипция и трансляция[править | править код]

Генетическая информация, закодированная в ДНК, должна быть прочитана и в конечном итоге выражена в синтезе различных биополимеров, из которых состоят клетки. Последовательность оснований в цепочке ДНК напрямую определяет последовательность оснований в РНК, на которую она «переписывается» в процессе, называемом транскрипцией. В случае мРНК эта последовательность определяет аминокислоты белка. Соотношение между нуклеотидной последовательностью мРНК и аминокислотной последовательностью определяется правилами трансляции, которые называются генетическим кодом. Генетический код состоит из трёхбуквенных «слов», называемых кодонами, состоящих из трёх нуклеотидов (то есть ACT, CAG, TTT и т. п.). Во время транскрипции нуклеотиды гена копируются на синтезируемую РНК РНК-полимеразой. Эта копия в случае мРНК декодируется рибосомой, которая «читает» последовательность мРНК, осуществляя спаривание матричной РНК с транспортными РНК, которые присоединены к аминокислотам. Поскольку в трёхбуквенных комбинациях используются 4 основания, всего возможны 64 кодона (4³ комбинации). Кодоны кодируют 20 стандартных аминокислот, каждой из которых соответствует в большинстве случаев более одного кодона. Один из трёх кодонов, которые располагаются в конце мРНК, не означает аминокислоту и определяет конец белка, это «стоп» или «нонсенс» кодоны — TAA, TGA, TAG.

Репликация[править | править код]

Деление клеток необходимо для размножения одноклеточного и роста многоклеточного организма, но до деления клетка должна удвоить геном, чтобы дочерние клетки содержали ту же генетическую информацию, что и исходная клетка. Из нескольких теоретически возможных механизмов удвоения (репликации) ДНК реализуется полуконсервативный. Две цепочки разделяются, а затем каждая недостающая комплементарная последовательность ДНК воспроизводится ферментом ДНК-полимеразой. Этот фермент синтезирует полинуклеотидную цепь, находя правильный нуклеотид через комплементарное спаривание оснований и присоединяя его к растущей цепочке. ДНК-полимераза не может начинать новую цепь, а может лишь

Генетическая генеалогия — Википедия

Генетическая генеалогия — раздел этногеномики, использующий ДНК-тесты совместно с традиционными генеалогическими методами исследования для выявления родства между людьми. ДНК-тестирование и ДНК-профилирование позволяют строить предположения о степени генетического родства. Применение генетических методов для составления семейной истории широко распространилось в 21 веке с удешевлением тестов. Тестирования проводятся как частными группами, так и в рамках исследовательских проектов (см. Геногеография).

По состоянию на 2019 год порядка 30 миллионов людей провели тесты, которые могут использоваться для выяснения родословной[1][2].

Обычно успех традиционных методов целиком зависит от сохранности и существования документов (например, переписных и писцовых книг, ревизских сказок и т. д.). Каждый человек несёт в себе своего рода «биологический документ», который не может быть утерян — это ДНК человека. Методы генетической генеалогии позволяют получить доступ как к тем частям ДНК, которые передаются практически неизменно по прямой мужской линии (Y-хромосома) и по женской линии (мтДНК), так и строить предположения по иным частям ДНК.

ДНК-тест Y-хромосомы позволяет, например, двум мужчинам определить, разделяют ли они общего предка по мужской линии или нет. ДНК-тесты не просто помощь в генеалогических исследованиях — это современный передовой инструмент, который генеалоги могут использовать для того, чтобы установить или опровергнуть родственные связи между несколькими людьми.

В процессе теста специальных ДНК-маркеров последовательность оснований в них повторяется множество раз (это называется «коротким тандемным повтором» (англ. Short Tandem Repeat)). Например, специальное оборудование читает последовательность ДНК так:

… CTGT TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTGCC …

Можно заметить, что TCTA повторяется 9 раз, а поскольку этот STR маркер называется DYS391 (DNA Y-chromosome Segment № 391) делается запись: DYS391 = 9.

В этом маркере число повторений может быть между 7 и 14. Y-хромосома уникальна в этом отношении, потому что не подвергается кроссинговеру с каждым новым поколением.

В результате слияния яйцеклетки и сперматозоида, ребёнок получает гены, которые будут являться смесью генов отца и матери. Но Y-хромосома передается только от отца, таким образом число повторов в маркерах сына будет тем же самым, что и у его отца. Диаграмма ниже показывает путь Y-хромосомы, которая путешествует вниз по всем мужским линиям, таким образом генетические кузены также разделят ту же самую Y-хромосому.

Иногда число повторов увеличивается или уменьшается, обычно в одной из линий. Таким образом, отец может иметь DYS391 = 9, а его сын DYS391 = 10. Это называется мутацией и случается, когда ДНК копируется неправильно. Стоит отметить, что мутация явление естественное.

Мутации очень важны, потому что учёные, зная примерную частоту их возникновения, могут высчитать приблизительное время, когда жил последний общий предок (MRCA, Most Recent Common Ancestor) (Y-хромосомный Адам, Митохондриальная Ева).

После проверки и объединения результатов нескольких STR из одного генома определяется гаплотип, который может быть представлен в виде последовательности числа каждого маркера. Тест из 12 маркеров может быть похож на данную таблицу:

STR Маркеры Y-ДНК
19 385a 385b 388 389i 389ii 390 391 392 393 425 426
Your Haplotype 14 12 17 12 13 29 24 11 13 13 12 10

Маркеры STR записаны в заголовке, а сам гаплотип в ячейках таблицы. Так, например, для DYS19 написано 14 повторов. Гаплотип может дать информацию о том, откуда произошла ваша Y-хромосома, то есть проследить весь путь предков данного человека в течение 100 тысяч лет. Например, атлантический модальный гаплотип (AMH) определен только шестью маркерами, и это самый общий гаплотип в Западной Европе.

19 388 390 391 392 393
14 12 24 11 13 13

В базе данных «YHRD» каждый может сравнить его гаплотип с другими занесенными в неё образцами[3]. Эта база данных содержит большое количество евразийских образцов, а теперь содержит ещё и образцы американцев и жителей восточной Азии, а также эскимосов. База данных YHDR использует до одиннадцати маркеров.

Кроме этого, Ybase — полезный инструмент исследователя, позволяет добавить результаты своих тестов Y-хромосомы в базу данных.

Интереснейший проект — база данных гаплотипов и генеалогических данных — «Sorenson Molecular Genealogy Foundation»[4]. После заполнения в критериях поиска гаплотип программа покажет в результатах самые близкие по совпадениям гаплотипы с фамилиями людей и покажет генеалогическое древо, где будет показан предполагаемый общий предок и все другие образцы, с которыми совпали результаты маркеров. В этой базе данных зарегистрировано более 50000 гаплотипов. На данный момент проект закрыли.

Тестирование Y-хромосомы наиболее интересно, если сравнивать результаты двух и более человек совместно с результатами традиционных генеалогических поисков. Ниже описан гипотетический случай, где три генетических кузена с одной фамилией прошли тест.

В какой-то момент в прошлом этой семьи произошла единственная мутация в Y-хромосоме. Эта мутация оставила след в ДНК всех мужчин этой семьи. При сравнении их гаплотипов наблюдается следующее:

Y-DNA STR Markers
19 385a 385b 388 389i 389ii 390 391 392 393 425 426
Кузен 1 14 12 17 12 13 29 24 11 13 13 12 10
Кузен 2 14 12 17 12 13 29 24 11 13 13 12 10
Кузен 3 14 12 17 12 13 29 24 11 14 13 12 10

В этой таблице большинство чисел совпадают, за исключением маркера, помеченного серым цветом. У участника № 3 показана мутация в DYS392. Участники № 1 и № 2, цифры которых полностью совпадают, очень близкие родственники. Участник № 3 тоже является их родственником, но более далеким.

Генетическая генеалогия помогает подтвердить результаты традиционных архивных исследований, показывая, что два или более человека с той же фамилией связаны родством, то есть имеют общего предка. Оценка времени жизни их гипотетического общего предка сводится к математике и статистике. Исследования показывают, что мутация в любом маркере — редкий случай, и происходит примерно каждые 500 поколений (то есть раз в 10000 лет). Если есть точное совпадение в 21 маркере, то среднее время, прошедшее с тех пор, когда жил общий предок (MRCA), только 8,3 поколений. Если есть хотя бы одно единственное несовпадение (мутация), тогда время увеличивается до 20,5 поколений.

Сколько мутаций (несоответствий) должно присутствовать в результатах тестов двух людей, чтобы можно было исключить их принадлежность к одному клану? Большое количество мутаций говорит о более отдалённом родстве или его отсутствии. В случае с 21 маркером 2 мутации между гаплотипами — это пограничный результат, а 3 мутации обычно исключают вообще достаточно близкое родство между этими людьми (в пределах тысячелетий).

В криминалистике[править | править код]

Правоохранительные органы могут использовать генетическую генеалогию для выявления лиц, виновных в преступлениях[5]. Этот вид криминалистической, следственной генетической генеалогии стал особенно популярен после ареста Джозефа Деанджело — американского серийного убийцы, насильника и грабителя[5]. Профиль ДНК преступника был помещён в генеалогическую базу данных GEDmatch, в результате чего были найдены его отдалённые родственники[5]. Дальнейшее расследование помогло раскрыть личность преступника. В то же время такое использование генетической генеалогии вызвало негативную реакцию экспертов в области защиты персональной информации[1][5].

В 2019 году генетическая генеалогия была объявлена в некоторых СМИ «самым мощным средством борьбы с преступностью со времён открытия ДНК»[6].

Некоторые исследователи генетической генеалогии[править | править код]

Публичные ДНК-базы данных

Y-ДНК проекты относительно фамилий

Компьютерные программы для исследования Y-ДНК

Статьи по теме

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *